Yon ekran High-debi pou agregasyon-Dapre inhibition nan yon Bibliyotèk Compound Gwo

Source: http://shoichetlab.compbio.ucsf.edu/publications/jm061317y.pdf

J. Med. Chem. 2007, 50, 2385-2390

2385

Yon ekran High-debi pou agregasyon-Dapre inhibition nan yon Bibliyotèk Compound Gwo

Brian Y. Feng,^†,§ Anton Simeonov,^‡,§ Ajit Jadhav,^‡ Kerim Babaoglu, ^†Jak Francs,^‡ Brian K. Shoichet,^*,† ak Christopher P. Austin^*,†

Depatman Chimi famasetik & Group Graduate nan Chimi ak Biyoloji Chimik, 1700 4th Street, University of California San Francisco, San Francisco, Kalifòni 94158-2330, epi NIH Chimik Sant Genomics, National Imèn genomic Research Institute, Enstiti Nasyonal Lasante, Bethesda, Maryland 20892-3370

Ou resevwa Novanm 13, 2006

High-debi tès depistaj (Hts) se teknik la prensipal pou idantifikasyon plon nouvo nan dwòg dekouvèt ak biyoloji chimik. Malerezman, li se fasil fo-pozitif frape. One mekanis ki komen pou positifs fo-sa yo se pèp la nan molekil òganik nan granula koloidal, ki nonspecifically anpéché anzim. A tou de evalye posibilite a nan gwo-echèl idantifikasyon nan total ki baze sou anpèchman ak quantifier prévalence li yo nan mitan frape tès depistaj, nou teste 70 563 molekil soti nan Enstiti Nasyonal Sant Sante Chimik Genomics (NCGC) nan bibliyotèk pou detèjan-sansib anpèchman. Chak te molekil tès depistaj nan omwen sèt konsantrasyon, tankou dòz sa-repons koub te jwenn pou tout molekil nan bibliyotèk la. Te gen 1274 inhibiteurs idantifye nan total, ki te anbigwite 1204 savon-sansib. Nou idantifye sa yo kòm inhibiteurs total ki baze sou. Fifty-yon molekil nan bibliyotèk yo te poukont li achte e teste yo ankò nan fè eksperyans segondè ki ba-debi; 29 nan sa yo te konfime kòm swa Aggregators oswa nonaggregators, jan sa apwopriye. Finalman, ak enfòmasyon ki dòz-repons yo kolekte pou chak konpoze, nou te ka egzaminen korelasyon ki genyen ant total ki baze sou anpèchman ak apik dòz-repons koub. Twa rezilta kle sòti nan etid sa a: premye, savon-depandan idantifikasyon nan total ki baze sou anpèchman se posib sou echèl la gwo. Dezyèmman, 95% nan aktiv yo jwenn nan paj ekran sa a yo se total ki baze sou inhibiteurs. Se twazyèm, total ki baze sou anpèchman Koehle ak koub apik dòz-repons, byenke pa absoliman. Rezilta yo nan paj ekran sa a yo te lage piblikman atravè baz done a PubChem.

Entwodiksyon

High-debi tès depistaj (Hts) se teknik ki pi toupatou itilize yo idantifye kandida nouvo kondwi pou dwòg ak pwodui chimik dekouvèt pwofonde. Malgre ke tès depistaj te gen siksè remakab yo, 1,2 li kapab tou jenere yon nimewo kap kwape nan fo-pozitif "frape". Règleman ki byen li te ye Lipinski a 3 yo te yon premye etap evite sa yo twonpe "frape"; Imedyatman, filtè enfòmatik pou yo te lajman deplwaye ann drapo konpoze Pwoblematik. 4-7 sa yo filtè eseye kaptire ki lakòz artifactual nan anpèchman nonspecific tankou molekil ki entèfere ak épreuves li-soti, 9 oksidasyon oswa pwodui chimik modifye sib la, 9-11 oswa fòm granula koloidal. 12-22 Nan sa a mekanis lèt, molekil ti oto-total nan yon sispansyon nan patikil laj ki Avègleman asosye ak pwoteyin ak anzim retire soti nan substra. Gen travay resan sigjere ke total ki baze sou anpèchman pouvwa eksplike yon gwo kantite inhibiteurs nenpòt, byenke egzakteman ki jan komen yo rete klè.

Desant ki baze sou anpèchman gen plizyè karakteristik karakteristik. Petèt pi èksplwatabl la nan sa yo se sansiblite sa a anpèchman ki pa-iyonik detèjan. 18,20 konsantrasyon Modere (0.01-0.1%) nan detèjan tankou pa sèlman deranje fòmasyon total, men li kapab separe entèraksyon nan pwoteyin-total ak anpèchman ranvèse. Nan pi bonè travay, nou eksplwate sa a karakteristik nan konsepsyon yon savon ki baze sou counter-ekran pou agrégation, kote se savon-sansib, total ki baze sou anpèchman izole nan savon ki reziste anpèchman. 12 Nou jwenn

* Pou ki moun yo ta dwe adrese korespondans. (BKS) Nimewo telefòn: (415) 514-4126. Faks: (415) 514-4260. E-mail: shoichet@cgl.ucsf.edu. (CPA) Nimewo telefòn: (301) 217-5725. Faks: (301) 217-5736. E-mail: austinc@mail.nih.gov.

^†University of California San Francisco.

^‡Enstiti Nasyonal Lasante.

^§Sa yo otè kontribye menm jan sa a travay.

ki paj ekran sa a counter-te ase serye evalye agrégation nan yon ti, bibliyotèk 1000-konpoze. Isit la, nou tès metòd sa a nan yon fòma ekran 1536-byen nan 70 563 molekil nan bibliyotèk la NCGC ti-molekil. Pou chak molekil, yon koub dòz-repons kap anglobe 7-15 an fèt nan pwen soti nan 3 NM a 30 Fim te kalkile dapre dènyèman dekri teknik la qHTS. 23 jan sa eksplike nan francs al et., 23 koub yo te klase 1 -4 dapre bon kalite, ak Klas 1 koub yo te adapte yo pi bon kalite epi montre yon tèt ak yon asenptòt anba.Gwoup 2 koub genyen yon asenptòt yon sèl, ak Klas 3 koub ki montre gwo anpèchman sèlman nan pwen nan konsantrasyon ki pi wo. Klas 4 koub yo asiyen nan molekil ki inaktif. Sa yo koub dòz-repons tou pèmèt nou fè ankèt konyensidans a souvan nan total ki baze sou anpèchman ak apik dòz-repons koub. Koub ak pant tankou Hill segondè yo souvan yon prezaj ki nan konpòtman pathologie, 24 epi nou te vle fè konprann si yo te yon endikatè a total ki baze sou anpèchman.

Isit la, nou adrès kesyon ki annapre yo: Eske épreuves la savon-depandan pou detekte Aggregators gaya nan yon ba-volim, fòma-wo debi? Ki jan répandus yo granula nan yon bibliyotèk tès depistaj ki byen òganize, ak kouman komen yo se yo kòm konpare ak lòt kalite inhibiteurs? Èske total ki baze sou anpèchman Koehle ak apik dòz repons-? Paske nou gen tès chak konpoze nan pa mwens pase sèt konsantrasyon atravè yon ran gwo, nou prevwa ki etid sa yo pral ofri gid itil a sa pouvwa ap atann nan kanpay tès depistaj, omwen kont sib anzim.

Rezilta

Bibliyotèk Konpozisyon. bibliyotèk la NCGC sa ki te fèt nan tès depistaj 563 70 molekil, pifò ladan yo te fè pati nan

10.1021/jm061317y CCC: $ 37,00 Published sou © 2007 Ameriken Chimik Sosyete Web 04/21/2007

2386 

Journal of terapetik Chimi, 2007, Vol. 50, No 10

Feng et al.

NIH Molecular Bibliyotèk Small Repository Molekil (MLSMR, http://mlsmr.discoverypartners.com/MLSMR_HomePage/, ~ 59 000 molekil). Konpoze sa a soti nan bibliyotèk jeneralman montre plon-tankou 25 oswa pran dwòg-tankou 3 pwopriyete. Te MLSMR a Anplis de sa complétée pa ti koleksyon yo soti nan fournisseurs ak divès kalite sous ki pa komèsyal (al gade materyèl ak Metòd).

Rezilta tès depistaj Apre optimize anzim, savon ikid, ak konsantrasyon substra (al gade materyèl ak Metòd), nou teste 70 563 konpoze nan bibliyotèk la NCGC ti-molekil kont β-laktamaz anba tou de savon (-) epi ak savon lesiv-(+) kondisyon (Figi 1a, b) yo. Savon a (-) ekran Yo te kouri kontinyèlman nan 65 h, pandan y ap savon an (+) ekran te fini nan 51 h. Akseptab siyal-a-bri nivo te reyalize nan tou de ka yo, lè yo mezire Z nòt la, yon sistèm metrik estanda nan bon jan kalite Hts. 26 savon a (-) ekran te gen yon mwayèn Z la 0.77, tandiske savon an (+) ekran te gen yon mwayèn Z la 0.82. Pou tou de dozaj, Z la se byen pi wo a 0.5, nòt nan Cutoff estanda pou fyab épreuves. Done kinetik pou chak reyaksyon Yo te ranmase, byenke pou analiz sa a sèlman premye ak dènye pwen yo te itilize kalkile anpèchman pousan (nou yo ap fè kou yo a tan plen nan chak reyaksyon piblik ki disponib, tankou sa yo pouvwa dwe yon sous itil nan done pou etid plis). Nou konsidere nenpòt ki molekil ki parèt dòz-depandan anpèchman yo dwe genyen yon aktif nan savon an (-) ekran. De kritè yo te itilize a dekri savon-sansiblite: premye, te chak koub dòz-repons kalitatif klase (klas la koub 23) sou baz la ak konplè nan la yo nan koub la ak bon kalite nan anfòm a (r 2.) Nou egzije koub la klas la Aggregators adoptif la gen plis defini (pi ba an valè klas koub) nan absans savon pase nan prezans li yo. Pou egzanp, yon molekil ki gen yon koub dòz-repons nan Klas 1 nan savon an (-) ekran, men nan men Klas 4 nan savon an (+) ekran, ta satisfè kritè sa a (Figi 1c, d). Dezyèmman, anpèchman nan maksimòm obsève atravè seri a titration te ap bese nan savon an (+) relatif ekran savon an (-) ekran. Nou te pran yon diminisyon enpòtan yo dwe 3 estanda-devyasyon inite soti nan diferans ki vle di nan aktivite sou adisyon nan savon pou bibliyotèk nan tout antye. By kritè sa yo, rezilta yo épreuves tonbe nan kat kategori: te savon-sansib anpèchman, savon-bra kwaze anpèchman, rezilta douteu, kote se sèlman youn nan kritè pou detèjan-sansib anpèchman satisfè, ak konpoze pou ki te gen okenn anpèchman obsève nan swa épreuves.

An jeneral, 1204 molekil (1.7%) te rankontre tou de anpèchman la ak kritè yo koub epi yo te idantifye kòm agrégation ki baze sou inhibiteurs, Lè nou konsidere ke se sèlman 70 (0.1%) te idantifye kòm savon bra kwaze. Sa yo enkli 70 25 li te ye β-laktamin inhibiteurs oswa substrats nan β-laktamaz. Molekil ki rete yo, 562 te kapab yo dwe kategori, montre se sèlman youn nan kritè pou detèjan-sansib anpèchman (Figi 2). Sa yo fèt prèske de nan molekil ki ekspoze nivo majinal nan anpèchman, epi, pandan y ap pi t 'montre kèk repons a savon ikid, yo tonbe deyò pòte an konfyans statistik. Aggregators varye nan kapasite yo nan anpéché β-laktamaz, men pifò ki pisan a te IC 50 valè tou pre 1/IM. Konsantrasyon-Depandans sa a nan molekil sa yo te konsistan avèk yon mekanis koloidal nan anpèchman; Aggregators kèk yo te detekte anba a 1/im, men pa 5 im/ 60% nan total inibitò yo ki baze sou te aparan.

Analiz Segondè. Pou tès fyab la nan sa yo mezi, 31 molekil yo te poukont li achte (sètadi, resous soti nan fournisseurs yo) ak teste yo ankò nan dozaj segondè. Molekil sa yo, idantifye nan ekran an kòm prensipal 17 Aggregators ak 14 inactives, yo te egzamine nan épreuves nan menm β-laktamaz, ki te kondi nan yon yon sèl-a-yon tan-kuv fòma. Malgre kondisyon yo nan sa yo eksperyans yo te menm jan ak

yon

Konsantrasyon Log

Figi 1. Yon nwaj dè pwen 3D nan done qHTS. Konsantrasyon-repons pou tout relasyon 563 70 molekil yo montre, ki gen koulè tankou: pa gen okenn relasyon (nwa), anpèchman (ble), oswa deklanchman (wouj). Konparezon ant detèjan (-) (a) epi ak savon lesiv (+) (b) tès depistaj revele nan prezans nan agrégation ki baze sou aktivite nan savon an (-) épreuves. Egzanp dòz-repons yo jwenn nan koub qHTS done pou reziste savon-(c) epi ak savon lesiv-sansib (d) inhibiteurs.

sa yo ki nan ekran an primè, sa yo fè eksperyans varye konsantrasyon nan DMSO, anzim, epi ak savon lesiv, osi byen ke volim nan reyaksyon (1 mL vs 8/ IL) ak longè chemen. Nan 17 molekil sa yo idantifye kòm Aggregators nan ekran an primè, 15 ekspoze anpèchman total-ki baze sou retesting nan la

High-debi Ekran pou agregasyon-Dapre inhibition journal of terapetik Chimi, 2007, Vol. 50, No 10

2387

Figi 2. Klasifikasyon ak dozaj la inhibiteurs yo te jwenn nan ekran an. 1204 molekil yo te idantifye kòm savon-sansib inhibiteurs, ki baze sou kritè de diferans ki genyen ant savon an (-) epi ak savon lesiv (+) kondisyon: deteryorasyon nan klas la koub nan molekil la, ak yon diminisyon nan anpèchman nan maksimòm obsève atravè seri a dekonsantrasyon. Molekil yo te swasanndis savon-bra kwaze inhibiteurs, 68 727 te montre pa gen okenn aktivite, ak 562 yo te Limit, sèlman ranpli youn nan de kritè ki nesesè yo yo dwe idantifye kòm yon inhibitor inibitè agrégation-ki baze sou.

Tablo 1. Rezilta nan Ba-debi analiz Segondè

Yon kondisyon tès depistaj Primè. ^bMwens-sevè kondisyon (4-pliye mwens anzim, 5-pliye mwens estabilize savon).

segondè épreuves. Menm jan an tou, nan 14 molekil ki inaktif refè tès la, pa gen inibe anba kondisyon tès depistaj maladi. Sepandan, 10 nan sa yo ekspoze anpèchman total ki baze sou ki nan pi gwo konsantrasyon oswa anba kondisyon épreuves dekontrakte, se sa ki, lè l sèvi avèk diminye konsantrasyon anzim ak mwens savon nan savon an (-) kondisyon pou yo épreuves prensipal la-wo debi (Tablo 1).

Yon prezante kirye nan done yo tès depistaj prensipal te ke kèk molekil a te parèt devan aktive β-laktamaz nan ekran an savon-gratis; sa a te deklanchman elimine sou adisyon savon lesiv. One nan sa yo aktivateur adoptif la yo te pou kont achte ak refè tès nan kondisyon plizyè nan ba-debi, dozaj kuv ki baze sou (Tablo 1). Kontrèman a Aggregators yo, epi

Tablo 2. Sansiblite nan kondisyon ese nan mitan "Nonaggregators"

Yon èkstrapolasyon IC₅₀ valè. ^bPi wo yo idrosolubl konsantrasyon.

nonaggregators idantifye nan ekran an primè, deklanchman pa te repwodwi nan sa yo dozaj segondè. Imedyatman, yon lòt 100 nan sa yo aktivateur aparan yo te re-souse nan fournisseurs yo, ak aksyon yo te rfe ki sòti dirèkteman nan poud solid. Konpoze sa yo yo te Lè sa a, teste nan kondisyon debi mwayen, tankou 96 - oswa 384-byen fòma. Paske nan volim ki pi gwo a nan sa yo dozaj, kòm konpare ak fason yo prezante 1536-byen, souvan li te posib yo obsève konpoze la imedyatman apre adisyon a épreuves la.Nan ka sa yo, nou souvan obsève sa ki parèt devan yo dwe precipitants, anjeneral nan fon an nan pwi a nan koòdone la sòlvan-polymère. Epitou, lè konpoze sa yo te pran tès nan komèsan sa yo ki pi wo yo, anpil nan aktivasyon an ansyen te atenye, byenke anpil nan sa yo konpoze t 'toujou mennen a deklanchman. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke se yon fenomèn deklanchman spesifik ak volim a, ki ba anpil-wo debi fòma yo itilize nan ekran an primè. Nou pa pral konsidere li lwen isit la.

Hill Analiz Pant. enfòmasyon sa a dòz-repons jwenn nan paj ekran sa a pèmèt nou fè ankèt korelasyon ki genyen ant total ki baze sou anpèchman ak apik dòz-repons koub, ki fè yo komen nan mitan-wo debi frape tès depistaj maladi. 19,24 Nou analize pant yo Hill la pi wo-bon jan kalite dòz-repons koub yo, ki fòme ak 174 inhibiteurs total-ki baze sou, 24 β-laktamin ki baze sou inhibiteurs irevokabl, ak 17 inhibiteurs revèsib nan β-laktamaz (Figi 3). Inhibiteurs yo revèsib parèt estanda, koub yon sèl-sit repons dòz ak pant tou pre 1, Lè nou konsidere ke inibitò yo β-laktamin yo te yon ti jan pi apik nan direksyon partial koub, jan yo espere a pou doktè inhibi-trè ki pisan. 27,28 Sepandan, Aggregators yo parèt yon tandans melanje: anpil te gen Hill Koefisyan fèmen nan 1, men anpil lòt moun te montre koub apik, menm pi apik pase bò inibitò yo kovalan β-laktamin, ak sanblab ak sa yo wè pou inhibiteurs lòt regwoupman 17 Nan 174 Aggregators yo nan sa a mete, 70 te gen Hill pant apik pase 1.5.

2388

Journal of terapetik Chimi, 2007, Vol. 50, No 10

Feng et al.

Figi 3. (a) korelasyon ant agrégation ki baze sou inhibiteurs ak moun ki gen pant Hill segondè. Konpare ak yon seri espesifik, inhibiteurs revèsib β-laktamaz ak yon seri inhibiteurs irevokabl, Aggregators yo gen plis chans gen apik dòz-repons koub. (B) Distribisyon nan Hill pant nan mitan molekil sa yo aktif dekouvri soti nan 18 anzim ekran kounye a komante nan PubChem. (C) Varyasyon nan pant yo nan molekil segondè pant Hill ki te teste nan omwen de dozaj anzim. Pant Hill parèt konsistan pou pifò nan molekil sa yo.

Sets done. rezilta yo plen nan sa yo ekran yo piblikman disponib atravè PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ak sou sit entènèt la Laboratwa Shoichet (http://shoichetlab.compbio.ucsf.edu/).

Diskisyon

Petèt konklizyon ki pi pratik ka tire nan paj ekran sa a se ke savon-sansib épreuves a kapab fiable idantifye inhibiteurs total ki baze sou anzim nan yon fòma vrèman-wo debi. Yon ekran counter-ki gen ladan of0.01% Triton X-100 efektivman separe 1274 aktiv épreuves nan 1204 Aggregators ak 70 molekil ki aji nan mekanis lòt

(Figi 2). Pouvwa sa a épreuves dwe itilize karakterize bibliyotèk lòt, oswa pouvwa dwe adapte ak anzim lòt pou itilize kòm yon dirèk vann san preskripsyon ekran-.

Mekanism Anpil moun te te pwopoze yo eksplike nenpòt anpèchman, ki gen ladan entèferans nan épreuves li-soti, 9 oksidasyon konpoze yo, 10 ak modifikasyon pwodui chimik nan sib la. 9-11 Yon rezilta enpotan nan paj ekran sa a se ke 95% nan ka aktiv yo dwe atribiye a yon yon sèl nan bagay sa yo: total ki baze sou anpèchman. Kouman yo ki rete 5% nan aktiv distribye nan mitan mekanism lòt, tankou vrè espesifik, anpèchman revèsib, se kounye a anba envestigasyon nan laboratwa nou yo; kèk nan mekanis sa yo se osi rapidman ak décisif idantifye kòm agrégation nenpòt. Ki sa nou ka di nan pwen sa a se ke 25 an 70 sa yo aktiv yo β-laktamin ki baze sou inhibiteurs nan β-laktamaz, ki aji nan kovalant modification nukleofil la Catalytic, Ser64. 29,30 Epitou, 5-10 nan sa yo parèt yo dwe granula ki rezistan a 0.01% Triton X-100, men yo sansib nan 0.1%, konsantrasyon nan yo itilize nan ekran orijinal la. 12 Sa a fèy sèlman apeprè 35 molekil ki aji pa tout mekanis ak lòt.

Malgre a vas majorite de frape nan paj ekran sa a inibe atravè fòmasyon total, pousantaj an jeneral nan Aggregators idantifye nan bibliyotèk la se pi piti pase sa nou jwenn nan yon inisyal yo, ekran ki pi piti-echèl. Etid sa a anvan sigjere ke anpil jan 19% de 298 tirajosò molekil dwòg-tankou konpòte kòm Aggregators a 30 mwen M. 12 de faktè kontribye nan sa a erè. Premye a gen rapò ak sansiblite de total ki baze sou anpèchman nan kondisyon épreuves. Pou rezon nan estabilite anzim nan fòma an 1536-byen, yon ba nivo de savon (0.0001%) te prezan nan savon an (-) ekran; sa a konsantrasyon nan savon se 5-pliye ki pi gran pase kantite lajan yo mande yo nan orijinal la byen 96- épreuves. 12 Anplis de sa, te konsantrasyon nan anzim ogmante relatif 4-pliye épreuves orijinal la, pandan y ap konsantrasyon nan savon yo itilize nan savon an (+) ekran te redwi 10-pliye 0.01%. Chanjman sa yo redwi kantite Aggregators jwenn anba detèjan (-) kondisyon, sa ki lakòz yon ekran pi sevè. Pami 31 konpoze sa yo teste yo ankò nan ba-debi dozaj segondè, kondisyon orijinal yo te gen plis sansib a total ki baze sou anpèchman pase kondisyon sa yo nouvo-wo debi. Te omwen yon diferans 2-pliye nan puisans obsève pou pifò Aggregators teste anba tou de kondisyon (Tablo 2). Finalman, nou pa ka rabè posibilite pou patipri konpoze nan mete nou orijinal de 298 règ-la-5-konfòme molekil. Bibliyotèk la NCGC pi gwo pa sèlman pèmèt pou plis Statistik gaya, men pouvwa curation atansyon li gen tou kontribye nan pousantaj ki pi ba nan total ki baze sou anpèchman.

Apik dòz-repons koub yo souvan harbingers nan patoloji nan Hts rezilta yo. 24 Paske Aggregators anpil yo te genyen tou koub sa yo, li se tante correspond fenomèn yo de. Titrage yo qHTS pèmèt nou fè ankèt sa a posibilite. Nou chwazi pi wo bon jan kalite dòz-repons koub yo, ki fòme ak 174 Aggregators, 17 li te ye deja espesifik, inhibiteurs revèsib nan β-laktamaz-(ki soti nan travay nou an anvan ak sa-a anzim) ak 24 li te ye espesifik, inhibiteurs kovalan (Figi 3). Klasik, inhibiteurs yo konpetitif tout te dòz-repons koub ki konsistan avèk sèl-sit anpèchman, ak Hill Koefisyan tou pre 1. Nan contrast, Aggregators yo te partial nan direksyon koub pi apik, ak yon pant mwayèn nan 2.2 kont yon pant mwayèn nan 0,7 pou inibitò yo revèsib. Koub yo rgroupeur yo tou te an mwayèn pi apik pase bò yon seri irevokabl β-inhibiteurs-laktamin, ki te gen yon pant Hill mwayèn nan 1.2. Apik dòz-repons koub yo pou laktam yo atann, yo bay jeneralman ba yo K d valè. 27,28 An tou, 40% (70/174) nan Aggregators yo te Koefisyan Hill ki pi konsekan pase 1.5. Epitou, chak konpoze ak yon segondè

High-debi Ekran pou agregasyon-Dapre inhibition

Hill pant te swa yon rgroupeur (93% nan moman an) oswa yon Modifier kovalan (7% nan moman an). Kidonk, ogmante Hill Koefisyan pouvwa ap variables serye nan anpèchman agrégation ki baze sou, oubyen, mwens souvan, ki pisan kovalan, byenke sa yo prediksyon pral tou manke kèk Aggregators. Pant yo Hill segondè nan toude inhibiteurs ki pisan kovalan ak agrégation ki baze sou, ak tout bon sa yo ki nan inhibiteurs ki pisan revèsib yo, yo gen orijin nan mécaniste menm: yo tout gen inhibiteurs stekyometrik ak ki ba anpil K d valè. Pou molekil sa yo, anpèchman se sèlman obsève lè konsantrasyon nan inhibitor inibitè apwòch sa yo ki an anzim lan. Paske lèt la se byen pi wo a vrè K d a nan inhibitor inibitè a, anpèchman leve trè byen vit sa a nan ranje konsantrasyon, ki mennen ale nan koub apik. Kidonk, pou tou de Aggregators ak sèten inhibiteurs kovalan, pant mòn pa gen anyen fè ak obligatwa koperativ ak tout bagay sa yo fè ak segondè anzim-a-K d pwopòsyon. 28

Yon kesyon ki natirèlman rive se konbyen fwa yo Aggregators yo te jwenn nan paj ekran sa a ou jwenn li tou kont ekran anzim lòt moun ki te MLSMR la. Plis jeneralman, granula vire moute ak frekans la menm nan ekran lòt yo? Li difisil reponn kesyon sa a dirèkteman nan pwen sa a: kèk nan ekran yo anzim rapòte nan tès PubChem tout oswa menm pi fò nan molekil sa yo MLSMR; tou kondisyon sa yo sou ekran an ak definisyon an nan "aktiv" diferan de épreuves épreuves (anpil sèvi ak savon lesiv, pou egzanp).Sepandan, youn kritè ki pouvwa yo dirèkteman konpare se pant yo Hill nan molekil aktif. Kòm sa a ekri, 18 ekran anzim ak Hill pant pou chak aktif yo ki disponib nan PubChem. Pou 18 sa yo ekran, 6254 aktiv (frape) yo te rapòte. Te sa yo, 1452 (23%) gen pant Hill ki pi konsekan pase 1.5 (Figi 3b). Pou moun ki molekil segondè pant Hill ki te teste nan de oubyen plis dozaj, koyefisyan a Hill te san patipri ki estab, sigjere ke sa yo mezi yo se serye ak ki transfèrab (Figi 3c). Nan ekran an β-laktamaz, tout molekil ki te gen apik dòz-repons koub yo te swa Aggregators (93%) oswa modifye kovalan (7%). Si modèl sa a fin ekran yo anzim lòt, li sijere ke, malgre itilize nan detèjan ak adjuvan lòt, plis pase 20% aktiv yo nan sa yo ekran yo tou Aggregators. Paske se sèlman apeprè 45% nan Aggregators yo ke yo idantifye nan etid sa a te gen pant Hill segondè, pousantaj la agrégation ki baze sou zafè nan mitan ekran yo anzim ki kapab pi wo toujou.

Enterè nou ki nan antreprann etid sa a te nan egzamen yon épreuves ki ta ka quantifier nan prezans nan total ki baze sou inhibiteurs nan yon anviwònman-wo debi. Opozisyon Plizyè merite mansyone. Yon konklizyon etone soti nan etid sa a se ke anpil nan aktiv yo te Aggregators, e konsa kèk ka dwe atribiye a mekanism lòt moun ki te anpèchman. Lè nou konsidere ke nou sispèk ke modèl ki sanble ta ka rive nan dozaj anzim ak lòt, ki enferans sa a se konfimen, tankou anzim ak pi gwo réskonsablité reaction pwodui chimik, oswa tout bon bibliyotèk ak eleman ki diferan, pouvwa montre modèl diferan. Epitou, nou sonje ke idantifikasyon nan yon molekil regwoupman pa diskalifye ki molekil nan aktivite nan lavni. Lè nou konsidere ke yo ta dwe Aggregators ki fèt nan kont pou ekran nan lavni, agrégation se konsantrasyon-yo ak kondisyon-depandan, ak yon molekil ki granula anba yon kondisyon ak konsantrasyon pouvwa konpòte byen anba kondisyon diferan oswa konsantrasyon pi ba yo. Pi enpòtan, counter-ekran pou agrégation ta dwe toujou konsidere kòm; yon sèl leson de etid sa a se ke dozaj tankou Pouvwa dwe senp.

Petèt responsablite a pi gran nan Hts se ensidan an nan fo-pozitif frape, ak mekanism gen anpil te pwopoze yo eksplike sa yo. Yon rezilta kle de etid sa a se ke, omwen pou anzim gaya tankou/ laktamaz-, 95% nan frape yo artifactual yo akòz yon mekanis sèl: koloidal agrégation ki te swiv pa sezi anzim. Ka sèlman 5% dwe atribiye a tout lòt

Journal of terapetik Chimi, 2007, Vol. 50, No 10 

2389

fòmil de anpèchman mete tèt yo ansanm, ki gen ladan modifikasyon kovalan, oksidasyon, ak entèferans épreuves. Pou byen-Konpòte anzim, fòmil yo reaction pwodui chimik sou ki jaden an pi enkyetid pouvwa dwe ra nan byen-organisées bibliyotèk yo. Olye de sa, li pouvwa pou konpòtman fizik la nan molekil òganik ki pi kontribye nan fo-pozitif frape nan tès depistaj maladi. Sètènman, dozaj ki inyore sa a risk efè ta pral nwaye nan yon lanmè an zafè. By nan menm pyès la, yon aspè nan ankouraje agrégation se ke li se yon fenomèn fizik ke nou ka espere yo konprann, epi pou ki nou ka kontwòl. Pragmatikman, nou ka deplwaye yon senp épreuves-wo debi yo detekte li; sa a kapab épreuves yo pral aplike ki pi koleksyon tès depistaj, nan pi wo-fòma dozaj yo, epi ka fè anpil priyorite molekil pou swiv-up eksperyans.

Materyèl ak Metòd

Bibliyotèk Compound te 70 563-manm nan bibliyotèk la ranmase nan men plizyè sous: 1280 konpoze farmakolojik aktif nan LOPAC (SIGMA-ALDRICH), 1120 eleman ki soti de Prestwick chimik (Illkirch, Frans), 280 fè sèvis pou mete pwodwi natirèl nan TimTec (Newark, DE), twa 1000-manm bibliyotèk konbinatwar soti nan farmakope (Princeton, NJ), 1106 eleman ki soti de Tocris (Bristol, UK), 59 684 eleman ki soti de Enstiti Nasyonal Sante Bibliyotèk Molecular Small Repository Molekil (MLSMR,http://mlsmr.discoverypartners.com/ MLSMR_HomePage), 1981 eleman ki soti de Enstiti a Kansè Nasyonal (Fikse la Divèsite NCI, http://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/diversity_explanation.html), 148 NCGC intern pwodwi konpoze, 20 konpoze kontwòl ki soti nan Shoichet laboratwa (UCSF), 96 β-peptides soti nan laboratwa a Gellman (Inivèsite Wisconsin, Madison), 726 eleman ki soti de University of Pittsburgh Sant pou Methodology Chimik ak Devlopman Bibliyotèk, ak 1121 konpoze ki soti nan Boston University Sant pou Methodology Chimik ak Devlopman Bibliyotèk. Te bibliyotèk la deplwaye kòm DMSO solisyon (7 L chak nan plak 1536-byen konpoze Greiner polypropylène) nan konsantrasyon premye rive ant 2 ak mm 10. Plak yo te seri dilye, ak konpoze yo te analize nan konsantrasyon final ki sòti from4nMto30 M. Plak-a-plak (vètikal) dilution ak 384-a-1536 konpresyon te fèt sou yon P3 Evolisyon dispanse sistèm ekipe ak yon tèt piptaj 384-tip ak de RapidStak inite (PERKIN-ELMER, Wellesley, MA). Plis detay sou preparasyon an nan bibliyotèk la konpoze yo bay yon lòt kote.

Aplikasyon épreuves te ekran an savon-depandan adapte ki sòti nan yon deja dekri, épreuves fòma 96-byen pou idantifikasyon nan inhibiteurs nenpòt. 16 Botwe nan yon fòma 1536-byen mande chanjman nan asire yon wo siyal-a-bri rapò; tou de yon yo te pliye 4-ogmantasyon nan anzim ak yon ogmantasyon 2-pliye nan konsantrasyon substra oblije kenbe yon wo siyal-a-bri rapò. Epitou, yon ogmantasyon 5-pliye nan konsantrasyon nan Triton X-100, yo 0,0001%, nan savon an ekran te bezwen estabilize anzim lan. Pandan se tan, te Triton X-100 konsantrasyon an nan savon-ekran an (+) bese soti nan 0.1% 0.01% pou fè pou evite depase fòmasyon jarèt. Ajisteman Teknik nan sistèm yo manyen likid yo tou te nesesè fè fas ak pwoblèm sa a. Finalman, dilution seri yo te pote soti nan 5-pliye entèval, sa ki lakòz nan pousantaj 0.3% nan DMSO.

β-Laktamaz analiz. AmpC β-laktamaz te fè sèvis pou mete yo ak analize jan sa dekri^17,31 sòf si gen endikasyon kontrè. Anzim lan te prezan nan 4 NM nan yon volim reyaksyon final 8 µL. Reyaksyon yo te fèt nan 1536-byen Greiner plak anba klè nwa, ak likid yo te okipe lè l sèvi avèk yon distribitè Solenoid-ki baze sou. Konpoze ak kontwole (23 NL) te transfere via yon PinTool Kalypsys ekipe ak yon etalaj 1536-zepeng epi inline estasyon lave yo. Plak yo te enkubatèd pou 15 min nan tanperati anbyan (22-23°C), ak reyaksyon yo te inisye nan adisyon nan substra (fonn nan zòn de defans, final konsantrasyon 400 µ M). Plak yo te imedyatman transfere nan yon ViewLux (PERKIN-ELMER)-wo debi ks imaje epi li chak nan 20 pou 4 min nan 480 nm. Pandan likid manyen, reaktif boutèy (AmpC, pezib, ak solisyon nitrocefin)

Journal of terapetik Chimi, 2007, Vol. 50, No 10

2390 

te rete nan yon submerged 4 bath ° C dlo. Tout operasyon tès depistaj te fèt sou yon sistèm Robotics Kalypsys (Kalypsys, Inc San Diego, CA) ki gen yon RX-130 ak de RX-90 antropomorfist bra Robotics. Te diferans lan absorption ant pwen yo tan fèk pase yo epi premye itilize kalkile pwogrè nan reyaksyon.

Kuv ki baze sou dozaj (1 volim reyaksyon ml) swa repwodui kondisyon ki anwo yo (kondisyon sevè) oswa ki genyen 1 NM AmpC β-laktamaz, 200 µM nitrocefin, ak 0,00002% Triton X-100 (kondisyon dekontrakte). Kuv ki baze sou dozaj ki genyen ant 1% ak DMSO 2%.Te konpoze ak anzim enkubatèd pou 5 min anvan ke yo te reyaksyon an inisye nan adisyon nan substra. Te Nitrocefin idroliz kontwole nan 482 NM sou yon HP8453 spèktrofotomètr UV-vizib.

Analiz done. yo te Inisyal koub-Fitting ak analiz done ki fèt menm jan li te dekri yo. 23 yon ti tan, konsantrasyon-efè relasyon yo te sòti lè l sèvi avèk lojisyèl GeneData pakè a Screener. Koub te kategori dapre anfòm bon kalite, mayitid repons, ak aktivite degre ofmeasured. Te Manyèl rimonté koub fè lè l sèvi avèk Graphpad 5.0. Rezilta yo nan sa yo ekran disponib atravè PubChem (http://shoichetlab.compbio.ucsf.edu/) ak sou sit entènèt la Laboratwa Shoichet ((http://shoichetlab.compbio.ucsf.edu/).

Referans

(1) Proudfoot, JR Dwòg, mèn, ak pòtre Dwòg: yon analiz de Gen kèk Dwòg Dènyèman lanse. Bioorg. Med. Chem. Dirije. 2002, 12, 1647-1650.

(2) Druker, BJ; Lydon, Klas NB aprann soti nan Devlopman an nan yon inibiteur abl kinaz tirozin pou leukemia myeloid kwonik. J. Klen. Envesti. 2000, 105,3-7.

(3) Lipinski, CA; Lombardo, F.; Dominy, BW; Feeney, PJ eksperimantal ak Enfòmatik Apwòch Estime solubility ak pèrmeabiliti nan Dwòg Dekouvèt and Settings Devlopman. Ad v. dwòg livrezon Rev, 1997 23,3-25.

(4) Rishton, GM Nonleadlikeness ak Leadlikeness nan biochemical

Tès depistaj maladi. DDT, 2003 8,86-96.

(5) Oldenburg, K. segondè debi Sonication: Evalyasyon pou solubilizasyon Compound. Peny. Chem. Segondè debi Depistaj 2005, 8, 499-512.

(6) Martin, yC Yon byodisponibilite Nòt. J. Med. Chem. 2005, 48,

3164-3170.

(7) Roche, O.; Schneider, P.; Zuegge, J.; Guba, W.; Kansy, M.; alanine, A.; Bleicher, K.; Danel, F.; Gutknecht, EM; Rogers-Evans, M.;

Neidhart, W.; Stalder, H.; Dillon, M.; Sjogren, E.; Fotouhi, N.;

Gillespie, P.; Goodnow, R.; Harris, W.; Jones, P.; Taniguchi, M.; Tsujii, S.; Vvon Der Saal, W.; Zimmermann, G.; Schneider, G. Devlopman nan yon Virtual Metòd pou Depistaj pou Idantifikasyon nan "frapeur souvan" nan Bibliyotèk Compound. J. Med. Chem. 2002, 45, 137-142.

(8) Hopkins, AL; Mason, JS; Overington, JP nou ka rasyonèl Design Dwòg nenpòt? Curr. Opin. Struct. Byol. 2006, 16, 127 -

136.

(9) Walters, WP; Ajay, A.; Murcko, MA Rekonèt molécules ak dwòg-Tankou Pwopriyete. Curr. Opin. Chem.. Byol 1999, 3, 384 - 387.

(10) Huth, J.; Mendoza, R.; Olejniczak, E.; Johnson, R.; Cothron, D.; Liu, Y.; Lerner, C.; Chen, J.; Hajduk, P. rmn Alam: Yon rapid ak rigoureux Metòd eksperimantal yo detekte reaktiv positifs Fo nan Screens biochemical. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 217-224.

(11) Rishton, GM konpoze reaktiv ak nan vitro positifs Fo nan

Hts. DDT, 1997 2, 382-384.

(12) Feng, pa; Shelat, A.; Doman, TN; Guy, rk; Shoichet, BIG

High-debi analiz pou Inhibitors nenpòt. Nat. Chem. Byol. 2005, 1, 146-148.

Feng et al.

(13) Seidler, J.; McGovern, SL; Doman, T.; Shoichet, BIG Idantifikasyon ak Prediksyon nan Inhibitors nenpòt regwoupman nan mitan konnen li

Dwòg. J. Med. Chem. 2003, 46, 4477-4486.

(14) Liu, H.; Wang, Z.; rgni, C.; Zou, X.; Tipton, PA Detaye Etid kinetik yon inibiteur regwoupman; inhibition nan Phosphomanno-mutase/Phosphoglucomutase pa Gaye Blue 56. byochmistri 2004,

27, 8662-8669.

(15) Feng, B.; Shoichet, BIG Synergy ak opozisyon an inhibition nenpòt nan Multiple-Compound melanj. J. Med. Chem. 2006, 49, 2151-2154.

(16) Feng, pa; Shoichet, BIG Yon ese Detergent-Dapre pou Deteksyon an Inhibitors nenpòt. Nat. Pwotokòl 2006, 1, 550 -

553.

(17) McGovern, SL; Caselli, E.; Grigorieff, N.; Shoichet, BIG Yon

Komen mekanism Underlying Inhibitors nenpòt soti nan Depistaj pou Virtual ak segondè-debi. J. Med. Chem. 2002, 45, 1712-1722.

(18) McGovern, SL; Helfand, BT; Feng, pa; Shoichet, BIG Yon

Espesifik mekanism ofNonspecific inhibition. J. Med. Chem. 2003,

46, 4265-4272.

(19) McGovern, SL; Shoichet, BIG kinaz Inhibitors:. Pa sèlman pou kinaz anymore J. Med. Chem. 2003, 46, 1478-1483.

(20) Ryan, AJ; Gray, NM; Lowe, PN; Chung, C.-w. Efè

Savon sou Inhibitors "nenpòt". J. Med. Chem. 2003, 46,

3448-3451.

(21) Frenkel, YV; Clark, AD, Jr; Das, K.; Wang, Y.-H.; Lewi, PJ;

Janssen, PAJ; Arnold, E. Konsantrasyon ak molécules agregasyon pH Depandan ofHydrophobic dwòg ak enpòtans nan bouch

Byodisponibilite. J. Med. Chem. 2005, 48, 1974-1983.

(22) Reddie, KG; Roberts, DR; dor, TM inhibition nan Kinesin

Motè Pwoteyin pa Adociasulfate-2. J. Med. Chem. 2006, 49, 4857 - 4860.

(23) francs, J.; Auld, D.; Jadhav, A.; Johnson, R.; Simeonov, A.; Yasgar, A.; W, Z.; CP, A. Quantitative High-debi Depistaj: Yon titrage -Dapre apwòch ki efikasman Idantifye Aktivite Biyolojik nan Bibliyotèk Chimik Gwo. Proc. NATL. Acad. Sci. USA

2006, 103, 11473-11478.

(24) Walters, WP; Namchuk, M. Screens Designing: kòman yo fè Hits ou yon Frape. Nat. Re v. Dwòg Disco v ery 2003, 2, 259-266.

(25) Hann, MWA; Oprea, TI kouri dèyè konsèp la Leadlikeness nan rechèch famasetik. Curr. Opin. Chem.. Byol 2004, 8, 255 -

263.

(26) Zhang, J.; Chung, T.; Oldenburg, K. yon senp parameters estatistik pou yo itilize nan analiz Evalyasyon ak Validasyon debi ofHigh Depistaj. J. Biomol. Depistaj 1999, 4,67-73.

(27) Straus, OH; Goldstein, ofEnzymes A. Konpòtman Zone: Ilistre pa rive vre nan disosyasyon Constant ak dilution sou sistèm nan Cholinesteratse-fizostigmin. J. Gen fizyol. lane 1943, 26, 559-585.

(28) Shoichet, BIG entèpretarya rèd Dòz-Repons Koub nan Bonè

Inhibitor inibitè Dekouvèt. J. Med. Chem. 2006, 49, 7274-7277.

Usher (29), KC; Blaszczak, LC; Weston, GS; Shoichet, BIG;

Remington, SJ ki genyen twa dimansyon Estrikti nan Ampc beta-laktamaz soti nan Escherichia coli Bound nan yon Tranzisyon Eta-analog: Enplikasyon posib pou ipotèz la Oxyanion ak

pou Design inibiteur. byochmistri, 1998 37, 16082-16090.

(30) Chen an, Y.; Minasov, G.; Roth, TA; prati, F.; Shoichet, BIG

Mekanism Deacylation nan Ampc beta-laktamaz nan Ultrahigh

Rezolisyon. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2970-2976.

(31) Weston, GS; Blazquez, J.; Baquero, F.; Shoichet, BIG Estrikti-Dapre EnhancementofBoronic rejenerasyon-Dapre Inhibitors ofAmpc beta-

Laktamaz. J. Med. Chem. lane 1998, 41, 4577-4586.

JM061317Y