Profile Metabolit în biologie a plantelor: platforme şi destinaţiile

Max-Planck Institutul de Fiziologie a Plantelor moleculară, Am Mühlenberg 1, 14476 Golm, Germania

Pentru toate e-mailurile autor, vă rugăm să faceţi Log on.

Genome Biologie 2004, 5: 109  Doi: 10.1186/gb-2004-5-6-109

Versiunea electronică a acestui articol este una completă şi pot fi găsite online la: http://science.webhostinggeeks.com/genomebiology-comments-ro

© 2004 BioMed Central Ltd

Abstract

Utilizarea optima a secvente genomului şi gene-expresie necesită resurse puternice platforme fenotipului, inclusiv cele pentru analiza sistematică a compoziţiei metabolit. Tehnologiile cele mai utilizate pentru profilarea metabolit, inclusiv masa rezonanţă spectrale, magnetică nucleară şi enzime bazate pe abordări, au diferite avantaje şi dezavantaje, şi pot apărea probleme cu fiabilitatea şi de interpretare a seturilor de date imens produs. Aceste tehnici vor fi utile pentru a răspunde la întrebări importante biologice în viitor.

Provocarea

Genele si gene pot fi ordonate de rutină, informaţiile rezultate stocate, accesate şi analizate, şi organismele cu expresia genelor modificate produs. Utilizarea acestor resurse necesită platforme puternice fenotipului, inclusiv abordări pentru analiza sistematică a compoziţiei metabolit. Întrucât chimia de acizi nucleici este relativ simplă şi uniformă, există zeci de mii de metaboliţi, cu o gama imensa de tipuri de structuri. Acest lucru a dus la o multitudine de extracţie diferite, de separare şi sisteme de detectare pentru diferite grupuri de compuşi metabolic importante. Cercetatorii au masurat de obicei, o mana de metaboliţi, aleşi pe baza unor presupuneri despre ceea ce a fost relevant şi capacitatea tehnică de laborator lor. Dar acum, în paralel cu dezvoltarea a genomului la nivel de gena-expresie tablouri, a existat o trecere la un "imparţial" de abordare a analizei metabolit.

Este util să se facă distincţia între amprentarea metabolit, profilarea metabolit şi metabolomica. Amprentarea metabolice este punerea în aplicare a unei tehnologii analitice larg, pentru a descoperi unele diferenţe mari între două eşantioane, de exemplu, două genotipuri diferite. Acesta oferă informaţii care vă ajută să se orienteze un proiect de cercetare. Profilarea metabolit este de măsurare de sute sau mii potenţial de metaboliţi. Este nevoie de o conducta raţionalizat pentru extracţie, separare şi analiză, astfel încât un număr mare de metaboliţi poate fi măsurată într-un mod robust şi cantitativă în timp ce în prezenţa amestec extraordinar de complex de produse chimice ("matrice"), care se găseşte în extractele celular. Metabolomica, în sens strict, este măsurarea toţi metaboliţii într-un sistem dat. Acesta nu este încă punct de vedere tehnic este posibil, şi va necesita, probabil, o platforma de tehnologii complementare, pentru că nici o tehnica unică este cuprinzătoare, selectiv, şi suficient de sensibil pentru a măsura-le pe toate[1]. Acest articol oferă o prezentare generală a tehnologiilor pentru profilarea metabolit, discută despre problemele legate de fiabilitatea şi interpretarea seturilor de date imens aceste tehnologii produc, şi subliniază modul în care acestea pot fi folosite pentru a răspunde la întrebări importante în biologie plante în viitor.

Hardware Platforme

Cromatografia de gaze cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS)

În cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă (GC-MS), compuşi sunt separate prin GC on-line şi apoi transferat la spectrometrul de masă pentru separarea în continuare şi de detectare. Aceasta combină două tehnologii complementare puternic: GC se pot separa metaboliţi, care au spectrelor de masă aproape identice (cum ar fi izomeri), în timp ce MS prevede modelele de fragmentare care diferenţiază între co-elutie, dar chimic diverse, metaboliţi. GC-MS oferă informaţii cantitative şi este utilizat pe scară largă pentru diagnostic clinic[2] şi pe scară largă de profile de probe biologice complexe[3 - 5]. Are şase paşi importanţi componente.

Extracţie

Prepararea unui extras ar trebui să fie ca non-selective şi cuprinzătoare cu putinţă. Dar, tratamente care stabilizează un singur set de metaboliţi duc adesea la degradarea sau modificări ale altora. În plus, ar putea fi necesar pentru a fracţiunilor separate, astfel încât să profilul metaboliţi urmări în cazul în care proba este dominată de un număr mic de metaboliţi foarte concentrate[6, 7].

Derivatizare

Derivatizare este necesar să se facă metaboliţi volatile, şi aşa mai cedat la GC-MS. Există un set de instrumente extins de reactivi chimici pentru GC-MS derivatizarea, inclusiv alchilanţi, acylating silylating şi reactivi[8]. În prezent, trimethylsilylation este alegerea favorizat[6]. Spre deosebire de alte reactivii, care sunt în parte foarte specifice pentru compusi chimici din anumite clase metabolit, trimethylsilylation utilizează reactiv cea mai cuprinzătoare şi, prin urmare cele mai bune în conformitate cu cerinţele unui metabolit profiluri non-părtinitoare.

Separarea prin GC

Condiţii extrem de standardizate sunt necesare pentru separarea de metaboliţi prin GC, deoarece modificări minore în condiţiile de gaz-flux, programarea temperaturii şi de tipul de coloană capilară afecta de retenţie cromatografică, şi poate chiar modifica ordinea în care sunt compuşi eluate [9].

lonization

Metoda de ionizare cel mai des utilizat pentru GC-MS este de electroni de impact (EI) ionizare, o abordare robustă, reproductibile, care nu este supusă la efectele supresia ion (interferenţă reciprocă între compuşi, care duc la unul sau ambele fiind subestimate sau nu sunt detectate, a se vedea glosar în Box 1 pentru mai multe detalii). EI transferă o încărcătură de energie fix de -70 eV la compuşi, şi compuşi sunt apoi transferate direct ca ionii moleculari de la priza de GC într-un vid de mare. Sarcina de energie depăşeşte energia de ionizare în primul rând molecule, ceea ce duce la generarea foarte eficient de ionii moleculari. Surplusul de energie este disipata prin foarte reproductibile, concentraţie-independent, fragmentarea ionii moleculari, care are două consecinţe importante. În primul rând, aproape toţi ionii moleculari transporta o sarcina pozitiva, care simplifică evaluarea spectrelor de masă. În al doilea rând, foarte reproductibile, combinate specifice masă spectrale fragmentarea model identificarea ajutoarelor de compuşi.

Detectare

Trei tipuri de mass-dispozitiv de detectare sunt utilizate în GC-MS cuplaje: Detectoare de unică cuadrupolar (QUAD), Ion-capcana tehnologie (SIFON), şi timp de zbor-detectoare (TOF; a se vedea caseta 1 pentru mai multe detalii). Tranzitată de GC-MS QUAD-sisteme (10-20 probe pe zi) se aseamănă cu cea de cromatografie tipice lichidă de înaltă performanţă (HPLC) aplicatii. GC-TRAP-MS tehnologie are o capacitate similară, dar include monitorizarea de reacţie (MS ⁿ) capacitatea, în care un fragment de masă predefinită este incluşi în eşantion (ion capcane-mamă) şi supus la o fragmentare secundară pentru a genera fragmente fiica. Acest lucru creşte selectivitatea şi suprima "zgomotul" produs chimic, un avantaj pentru analiza urmelor de compuşi în probe complexe[6, 7]. De asemenea, ajuta la identificarea de compusi. GC-TOF-MS sisteme permit transfer superior (10-50 scanări pe secundă, permiţând probe 30-40 pe zi).

Evaluare

Compuşi sunt identificate prin potrivirea lor ori de retenţie cromatografică şi mass-spectrale modele fragmentarea informaţiilor cunoscute şi a prezis disponibile în bazele de date [9]. Tipice GC-QUAD-MS software necesită cunoştinţe de specialitate cu privire la masele fragment caracteristic si ferestre timpul de retenţie de fiecare metabolit, şi de capcanele care pot conduce la unei identificări eronate. Acumularea de experienţă este consumatoare de timp, dar este ajutat de crearea de mass-spectrale şi de retenţie-time biblioteci de referinţă indicele pentru toţi metaboliţii care apar de rutină. Acest proces necesită manual sprijinit în jurul valorii de 2 minute pe metabolit, permiţând aproximativ 20 fişiere cromatogramă care vor fi evaluate pe zi (cu un număr tot mai mare de metaboliţi acest pas este rata de limitare a analizei eşantionului). Un avantaj major al GC-TOF-MS sisteme (cum ar fi GC-TOF-MS de la Pegasus II LECO Corp Inc, Sf. Iosif, Statele Unite ale Americii) este capacitatea lor de software-ului[9, 10], care susţine extracţie automată şi cuprinzătoare a tuturor spectrelor de masă de la o cromatogramă, în mass-a construit-spectrale de corecţie pentru co-elutie metaboliţi, calcularea indicilor de retenţie-timp, şi alegerea automată a unei mase fragment potrivit pentru selectivă cuantificare. GC-TOF-MS are potenţialul de a fi cu adevărat non-părtinitoare şi complet automatizat cu privire la identificarea metabolitului, dar în prezent este încă nevoie de expertiză pentru a corecta sarcini nepotrivite.

În general, aproximativ două zile sunt necesare pentru a transporta un lot de 50 de eşantioane prin extracţie şi paşii derivatizare [4]. Analiza şi evaluarea de un eşantion (derivatizare, separarea prin GC şi de ionizare) necesită 60-75 de minute cu GC-QUAD-MS sau 35-45 minute cu GC-TOF-MS. De transfer este depăşită numai prin tehnologii prelevarea amprentelor digitale, sau analize specifice de metaboliţi unice. Problemă majoră este de evaluare şi de a verifica manual pentru metaboliţi identificat greşit. GC-MS prevede cuantificarea exactă a nivelului absolut al unui metabolit dat într-un interval de concentraţii de până la patru ordine de mărime, cu condiţia că standardizarea corespunzătoare externe şi interne a fost efectuată. Fiecare pas în timpul extragerea, prepararea şi analiza poate introduce generale şi specifice substanţei pierderi, totuşi, şi acestea pot varia în funcţie de materialul biologic. În mod ideal, fiecare compus ar trebui să fie standardizate folosind un isotopomer stabil-izotopi cu etichetă, care este diferential detectabil prin spectrometrie de masă, sau un stereoizomer xenobiotice, care se distinge prin proprietăţile sale cromatografică[4, 11]

O limitare majora este ca GC pot fi utilizate numai pentru compuşii volatili sau compuşi care pot fi transformate chimic în derivate volatile (a se vedea [12] pentru o listă). Metodele actuale de a detecta trizaharide, steroizi, digliceride şi unele metaboliţi monophosphorylated (cum ar fi glicerol 3-fosfat şi glucoză 6-fosfat), dar cele mai multe intermediari polyphosphorylated şi activate metabolic nu sunt în prezent accesibile la GC-MS analize (a se vedea figura1 pentru un exemplu de un experiment profiluri GC-QUAD-MS).

Limitarea alţi mari de GC-MS este că cele mai multe vârfuri sunt încă neidentificate. Acesta este un tribut adus sensibilitatea ridicată şi rezoluţia de capilare GC-MS, dar o frustrare pentru biolog. Unele "necunoscute" poate fi analizat generate în timpul pregătirii de extracţie şi probei, sau prin fragmentarea în pasul SM, dar altele pot fi chiar importante şi metaboliţi noi. Identificarea lor este, prin urmare, o activitate importantă, care creşte cumulativ puterea de GC-MS platforme. Abordarea directă presupune plus faţă de bateria de metaboliţi autentificat standard, că interesul biolog. Elucidarea identitatea de un vârf de interes este mai dificil, cu toate acestea, deoarece GC-MS este distructiv şi, de obicei nu genereaza substanţă suficient de pură pentru elucidarea structurale (de exemplu, micrograme superioară a gamei mg necesare pentru deconectat rezonanţă magnetică nucleară, RMN).

Cromatografie lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS)

Cromatografie lichidă cuplată la MS (LC-MS) exploateaza puterea de separare ridicat de HPLC, inclusiv capacitatea sa de a separa compuşi cu greutate moleculară mare, care nu pot fi analizate prin GC. O gamă enormă de coloane şi procedurile de eluare sunt disponibile. În mod tradiţional, HPLC a fost cuplat la lumina ultraviolete şi vizibile (UV / VIS) sau de diode detectoare. De cuplare-l la MS prevede în schimb selectivitate în continuare, de detectare a imparţial, şi informaţii despre structurile de compuşi separate. Metaboliţi sunt introduse în spectrometru de masă cu ionizare electrospray (ESI). ESI este un proces de presiune atmosferică, transferul de molecule care se eluează analitului dintr-o coloană HPLC în faza de gaz adecvat pentru analiza masă. Analiţilor introduceţi spectrometru de masă ca moleculele acuzat că sunt transportate într-un câmp electric între sfârşitul coloanei şi intrarea în spectrometrul de masă. Ionizarea poate avea loc prin intermediul protonation (ESI+) sau deprotonation (ESI-)[13, 14] şi poate duce la ioni unice şi multiple. Prezenţa ionilor de mai multe schimburi a raportului mass-la-taxa (m / z), chiar şi de înaltă masă analizate în intervalul de scanare a unui analizor de masă tipic. Atunci când este combinată cu ESI spectrometre de masă cu high-end, nu există nici o restricţie în mod eficient mass-gama, care permite proteine complete care urmează să fie analizată[15]. ESI are o prejudecată împotriva compuşi mai puţin polare, cum ar fi terpene, carotenoide şi aliphatics, pentru care este mai bine să utilizaţi proceduri alternative, cum ar fi photoionization presiunea atmosferică (APPI)[16] sau GC-MS.

Informaţiile structurale se obţine prin coliziune induse de descompunere [17]. Ionii de mamă produse de ESI sunt izolate şi accelerate în interiorul spectrometru de masă prin utilizarea de filtre cuadrupolar masă (a se vedea caseta1), forţându-le să se ciocnesc cu moleculele de gaz baie (de obicei heliu sau argon). Spectrului de frecvenţe fragment care rezultă pot fi comparate cu bibliotecile fragmentarea pentru structuri chimice cunoscute. În funcţie de analizor de masa utilizate, spectre fragment multe ori pe secundă pot fi efectuate "on the fly". Utilizarea capcane cuadrupolar ion este în continuare posibil pentru a genera spectre fragment din mai multe fragmente selectate de o masă de ioni-mamă (a se vedea caseta1 pentru informaţii suplimentare).

Evaluarea are nevoie de cunoştinţe de specialitate. Complicaţiile apar din amestec cromatografic, consolidarea sau suprimarea de ionizare în matrici complexe, precum şi prezenţa ionilor de mai multe[18]. Acest lucru face că este vital să se dezvolte protocoale robuste şi standardizat, şi să includă verificări de rutină în cazul în care modificările în amestec complex de compuşi într-un extract biologic afectează separare şi analize.

Acte triple cuadrupolar permite cuantificarea de către o singură reacţie de monitorizare (SRM). Un ion de masă specifice - metabolitul de interes - este selectat 'on-the-fly ", cu primul filtru de masa cuadrupolar, fragmentat în două cuadrupolar, şi un fragment de corespunzătoare este apoi selectat în cuadrupolar treia. SRM oferă foarte specifice mass-ion urme de metaboliţi preselectate, care apoi pot fi cuantificate prin integrarea de vârf. Acesta oferă o mare selectivitate şi sensibilitate, dar poate fi aplicat doar la metaboliţi care s-au cunoscut căile de fragmentare. De asemenea, poate fi aplicată doar pentru un anumit număr de metaboliţi pe alerga.

LC-MS a fost, în principal utilizate pentru a analiza metaboliţi selectat [19], dar aceasta are un potenţial enorm pentru profilarea metabolit, ca o completare la GC-MS. De înaltă rezoluţie spectrometrie de masă[20] (detectarea 11000 ionii de masă într-un spectru unic) şi de înaltă rezoluţie cromatografie[21, 22] va creşte în continuare număr de metaboliţi detectate. Cele mai mari provocari sunt de a dezvolta o procedură automată de evaluare şi cuantificare metabolit din cromatogramele prime similare cu cele deja disponibile pentru GC-MS[23, 24], şi pentru a descoperi identitatea de numărul imens de metaboliţi necunoscuţi şi a analizat detectate de aceste platforme analitice puternice. Acest lucru poate fi realizat folosind informaţiile structurale din partea statelor membre ⁿ capactity de LC-MS sisteme[18, 25], şi prin combinarea LC-MS cu Fourier transforma-ion rezonanţă ciclotronică spectrometrie de masă (FTICRMS) şi RMN.

Fourier transforma-ion rezonanţă ciclotronică spectrometrie de masă

În Fourier transforma-ion rezonanţă ciclotronică spectrometrie de masă (FTICRMS), extractele sunt direct perfuzat în instrumentul MS folosind tehnici moi ionizare, pentru a obţine amprentele digitale ale ionii moleculari prezent [26]. Această tehnică necesită un analizor de masă de precizie suficientă pentru a genera formule empirice definitiv pentru câteva sute de ioni. Pentru profile, aceasta are în prezent două limitări majore. În primul rând, lipsa de cromatografie îl face incapabil de a distinge între izomeri, din cauza maselor lor moleculare identice, ceea ce face o discriminare clară de metaboliţi multe imposibilă. În al doilea rând, nu există nici o documentaţie metodei de validare viguroase, care este necesară pentru a susţine utilizarea sa pentru analize metabolitul. Aceste limitări deoparte, este clar că de cuplare de o astfel de maşină la aparate de măsurare de înaltă calitate, care permit separarea de analizat ar permite o precizie mult mai mare de identificare - chiar dacă la un cost cu o schimbare mare în ceea ce priveşte tranzitată probă.

Rezonanţă magnetică nucleară spectroscopie (RMN)

O abordare radical alternativă este de a utiliza RMN pentru a detecta si cuantificarea metaboliţilor, prin intermediul proprietăţilor magnetice ale izotopilor de atomi constitutiv. În principiu, această abordare va detecta o gamă extrem de largă de metaboliţi, deoarece pe bază de hidrogen, carbon, azot, fosfor şi oxigen au izotopi magnetice care sunt detectabile prin RMN[27, 28]. Analiza de calcul şi software-ul chemometrice sunt foarte dezvoltate, care să permită procesarea rapidă a datelor achiziţionate spectrale şi identificarea metaboliţilor din semnalele.

În practică, însă, RMN detectează metaboliţilor mai puţine şi are o gamă mai dinamic decat MS-bazate pe tehnologii [5]. Deşi în jurul valorii de 2,700 analizat au fost detectate într-un studiu de extracte din plante cu ajutorul RMN-LC[29], mai puţin de 50 au putut fi cuantificate şi identificat fără echivoc. Sensibilitate mai mici de RMN bazate pe tehnici le limitează la cuantificarea compuşilor cele mai abundente[30, 31] sau clase de compuşi unică[32, 33]. În sondajele largă, acestea furnizează informaţii în principal, non-cantitative[34].

Deşi spectroscopie RMN este de utilitate limitată pentru profilarea metabolit, este important pentru determinarea fără echivoc a structurii metabolit, care este unul dintre obstacolele majore ale profilului metabolit. Două alte caracteristici, de asemenea, face extrem de important pentru aplicaţii specifice: acesta poate fi utilizat pentru a studia nivelul metabolitul in vivo, chiar dacă doar pentru un metaboliţi câteva majore[27, 28], şi poate fi folosit pentru a se descurca fluxurilor complexe metabolice cu următorul text atomilor marcaţi prin intermediari metabolice la nivel atomic[35].

Evoluţii în teste UV / vizibil spectroscopice şi pe bază de enzime

Există nenumărate metode pentru detectarea unor compuşi specifici sau grupuri de compuşi, folosind UV / lumina vizibila absorbanţa, fluorescenta sau luminiscenta. Metaboliţi sunt detectate în mod direct, sau după separarea cromatografică, sau după chimice specifice sau reacţii enzimatice au convertit un metabolit dat într-un analit care poate fi detectat spectroscopically. Există adesea diverse metode disponibile pentru orice metabolitul unul, diferite în sensibilitate, specificitate, debit, sau în tipul de echipament necesar[36]. Este dificil să se bazeze o platformă high-throughput de profile în jurul valorii de astfel de proceduri şi instrumente diverse. Ei, totuşi, prevedea o componentă importantă în orice platformă de profile, deoarece, de exemplu, acestea permit cuantificarea sensibile de low-level intermediari fosforilate şi coenzime[37]. Spectrofotometria prevede, de obicei, sensibilitate în intervalul nanomole, iar acest lucru poate fi crescut de 100 - la 1000 de ori prin folosirea enzimei de activare[38], o enzimă-inhibarea[39] sau cu bicicleta[37] teste, fluorimetry[40, 41] şi luminometry[42].

Aceste teste permit dedicat high-throughput de analiză, care este crucială pentru scopuri de diagnostic şi pentru proiectarea de experimente profile, un aspect de genomica functionala a căror importanţă este frecvent subestimată [43]. Un laborator echipat cu un cititor microplacă simplu test poate calcula şi rezultatele pentru câteva sute de extractele într-o zi. Capacitate poate fi crescut la peste 100.000 de analize pe zi, prin tehnologia microplăci combinarea cu robotica[44]. Strangulare pentru astfel de abordări este apoi pregătirea şi extracţie de probe.

Evoluţia de high-throughput teste este legată de miniaturizare pentru a economisi materiale, costurile si timpul. In timp ce tehnologia microplăci este aproape de saturaţie în ceea ce priveşte scalare în jos, noi tehnici bazate pe microcip, cum ar fi chips-uri microfluidic care operează în gama nanoliter[45] va creste dramatic costurile de transfer şi, de asemenea, mai mici[46]. Un utilizare va fi în asociere cu reacţii enzimatice care generează produse fluorogenic care permite detectarea sensibile. Acest lucru va fi probabil limitat de disponibilitatea de enzime si substraturi, cu toate acestea. O altă abordare va fi de a utiliza apoenzymes (proteine care se leaga substratul lor fără cataliză suplimentare) topită la fluorophores, permitand legarea substrat şi schimbările care rezultă conformationale care urmează să fie detectat de fluorescenţă. Crearea de biblioteci mai mare parte a apoenzymes care acoperă diferitele părţi ale metabolome ar putea duce la o nouă generaţie de metode de profile ultra-high-throughput.

Credinţa este bună, dar controalele sunt mai bine

Complexitatea chimică a metaboliţilor şi extracte face controale de extracţie şi procedurile analitice vitale. Fără ele, nivelurile raportate pentru un ţesut special, poate fi incorecte, şi diferenţe raportate între ţesuturi ar putea fi artefacte din cauza pierderilor diferenţial în contrastante matrici. Comparativ cu transcrieri şi proteine, metaboliţi au rate ridicate cifra de afaceri. Este imperativ de a recolta ţesut de interes, fără să îl supună unei tranzitorii - de exemplu, de schimbarea intensităţii luminii - care ar putea modifica nivelurile de metaboliţi (a se vedea[43]). Perturbarea structurii celulare duce la amestecul de metaboliţi cu enzime, care sunt în mod normal, sechestrate într-un compartiment subcelulara diferit sau de celule, iar acest lucru degradează metaboliţii rapid. Este esenţial pentru a potoli metabolismului destul de repede pentru a preveni post-extracţie modificări în nivelurile de metabolit (prin congelare în azot lichid, de exemplu, sau a tesutului squashing între blocuri metalice de dimensiuni mari precooled în azot lichid). Având în vedere diversitatea chimică a metaboliţilor, este imposibil de a elabora o metodă care permite toate acestea să fie cantitativ şi total extras. Procedurile de extracţie şi de manipulare extras trebuie să fie reglate, prin urmare, la întrebarea biologice de interes - care metaboliţi este esenţial pentru a măsura cu precizie cât mai mare? De exemplu, pentru a măsura metaboliţi care sunt susceptibile de a defalcare enzimatic, este esenţial de a inhiba total întreaga activitate a enzimelor (a se vedea[43]). Acest lucru necesită tratamente (cum ar fi de extracţie în acid tricloracetic), care va degrada sau derivatize alţi metaboliţi.

De extracţie şi analiza ar trebui să fie optimizate şi de rutină verificate pentru metaboliţii specifice de interes, prin marcarea probele de tesut cu mici cantităţi de standarde chimice autentificate doar înainte de extracţie [12]. Astfel de experimente "de recuperare", ar trebui să fie repetat cu fiecare tesut nou, sau cu fiecare tratament care afectează puternic spectrele enzimelor sau de metaboliţi (de exemplu, fructe maturare sau atac patogen). Acest lucru devine imposibil atunci când sute sau mii de metaboliţi sunt analizate. În astfel de cazuri, o strategie de generic este necesară pentru controlul calităţii. Cel mai simplu este de a amesteca 01:01 ţesuturile cu un şerveţel standard, pentru care procedurile au fost deja validate, şi pentru a verifica pentru fiecare analit individuale care nivelul din amestec este media aritmetică a nivelului în ţesuturi individuale. Această abordare a fost utilizată, de exemplu, în adaptarea de GC-MS protocoale de măsurare a fructelor de tomate[47]. Un bonus este faptul că oferă informaţii suplimentare privind păstrarea timp schimburi între ţesuturile standard şi noi, şi că aceasta identifică rapid diferenţele în intervalul dinamic al nivelurilor metabolit între ţesuturi.

Software-ul sens, şi de a face de o mulţime de date

Deoarece profile metabolit este ieftin o dată pe platformele hardware au fost stabilite, acesta poate fi aplicat la un număr mare de probe pentru a genera cantităţi enorme de date. Blocaj următor este în găsirea căilor de a combina şi să interpreteze datele. O primă, aparent banal, pas este de a dezvolta o sintaxa clar definit pentru toate metaboliţii fiind măsurat. Acest lucru este analog la stabilirea de o listă completă a tuturor genelor intr-un organism, dar este mult mai complexă, deoarece nu există nici o secventa genomului care poate acţiona ca un punct de referinţă, şi din cauza numărului mare de sinonime şi derutante lungime de mai multe denumirile chimice. Primii paşi către acest obiectiv sunt luate, dar este o călătorie grea şi necesită o combinaţie de cunoştinţe de specialitate de metaboliţi şi de text-mining algoritmi.

Colecţii de date de profile metabolitului conţin un număr mare de puncte de date experimentale pentru fiecare parametru, şi sunt bine adaptate pentru data mining. Analiza cu instrumente statistice pentru a detecta corelaţii şi grupări de unităţi de dobândirea de cunoştinţe imparţial, prin identificarea relaţiilor necunoscut. Analiza prin analiza componentelor principale, analiza componentelor individuale sau maşină-learning abordări pot fi folosite pentru a descoperi tipare importante sau diferenţe în nivelurile de metabolit[4, 12]. Acest lucru va genera conduce pentru experimentare în continuare şi să definească "diagnostic", metaboliţi, care poate fi apoi selectiv măsurată în moduri foarte high-throughput.

Metabolizare este notoriu de neînţeles pentru non-specialist. În paralel cu informatice bazate pe abordări, sunt necesare instrumente de acel loc metabolitul-profile de date într-un context biologic. Baze de date metabolice (cum ar fi KEGG[48]) furnizează informaţii exhaustive despre rolurile posibile ale unui metabolit dat, pe baza informaţiilor compilate de la procariote şi eucariote numeroase. Ele sunt utile pentru referinţă, dar descurajanta pentru non-specialisti. În astfel de baze de date, parcursuri sunt definite ca retelele mari, informaţia este incluzivă, mai degrabă decât specifice, şi este adesea neclară care căi sau sectiuni din ele operează în care organismul. Recent, o prima de a construi resurse AraCyc a fost publicată[49, 50]. Această bază de date va asambla cumulativ informaţii despre căi metabolice diferite de plante, oferind diagrame care arată metaboliţilor şi genele care codifica enzimele în fiecare cale. Următorul pas este de a dezvolta instrumente pentru a afişa date metabolit pe diagrame de cai. Acest lucru a fost abordat de către Thimm et al.[51, 52] cu un instrument numit MapMan care permite utilizatorilor să picteze metabolitul-out pe seturi de date de profile şabloane existente, sau pe ei înşişi diagrame de design. MapMan locuri, de asemenea, date metabolit într-un context mai larg, în asociere cu o expresie-profilare seturi de date şi, eventual, cu informaţii despre proteine şi activitatea enzimelor.

Înapoi la biologie

Măsurătorile de metaboliţi să furnizeze informaţii de bază despre răspunsurile biologice la schimbările fiziologice sau de mediu. Profiluri Metabolit permite o trecere de la ipoteza bazată pe cercetare pentru a analiza la nivel de sistem de răspunsuri, mai ales atunci când este integrat cu tehnologii de profile altele (a se vedea, de exemplu,[53, 54]). După care caracterizează răspunsul, următoarea sarcină este de a elucida mecanismele de reglementare. Investigaţie sistematică a tuturor de metaboliţi în decurs de o parte, sau segment, de o reţea metabolic prevede o strategie puternică şi imparţial pentru identificarea site-ul sau site-uri la care mecanismele cheie pentru a modifica actul de fluxuri. Enzima reglementate este revelat, deoarece nivelul de substrat sale (e) modificări reciproc pentru a fluxului prin calea (a se vedea, de exemplu,[55]). Metabolitului-profilare seturi de date pot fi, de asemenea, analizate pentru a descoperi chemometrically corelaţii între metaboliţii individuale şi nivelurile de expresie a genelor specifice[53] sau proteine[54]. În epoca post-genomica, profile metabolit vor fi folosite tot mai mult pentru a fenotipului mutanţilor şi a organismelor transgenice, astfel încât să se definească rolul unei gene. Una dintre provocările majore în genomica functionala este de a atribui funcţiile la mai multe gene slab sau unannotated[56]; profile metabolit va oferi o cheie pentru cei care codifica proteine implicate in metabolismul.

În domeniul ameliorării plantelor, întrebări legate de compoziţie moleculară şi implicaţiile sale pentru nutriţie şi sănătate se deplasează în prim-plan. Progresele tehnologice sunt accelerarea introducerii de noi diversităţii în programele de reproducere, fie prin intermediul tehnologiei transgenice sau prin utilizarea markerilor moleculari în asociere cu cruci largi. Profilului Metabolitul poate fi utilizat pentru a caracteriza această diversitate fenotipic cu privire la compoziţia metabolitul său, oferind o resursă puternică pentru a ghida programe de creştere şi să îi alerteze cercetatorii de la un stadiu incipient de trăsături pozitive sau negative. Puterea acestei abordări va fi considerabil sporită în cazul în care acesta poate fi combinat cu un studiu sistematic cu privire la componenţa metabolit al produc plante care sunt deja pe piaţă. Precum şi furnizarea de o linie de referinta, aceasta va oferi, de asemenea, un cadru raţional pentru evaluarea riscurilor prin intermediul "substanţial de echivalenţă": profile metabolit va fi utilizată pentru a determina compoziţia metabolitul de produse noi, care pot fi comparate cu gama de metaboliţi în produc deja disponibile. În plus, profile metabolice va oferi informaţii importante în cercetare nutriţionale, şi în dezbaterea publică cu privire la acceptabilitatea de modificări în lanţurile de producţie alimentară.

Una din provocările majore pentru ştiinţele vieţii, în deceniile următoare este de a muta dincolo de cunoştinţe detaliate despre organismele şi răspunsurile lor în medii de laborator controlate sau pentru a înţelege interacţiunile complexe în ecosistemele naturale şi în timpul evoluţiei. Amestec de debit mare şi lăţimea va permite profilare metabolit să fie integrat în studiile ecologice, care necesita strategii de eşantionare mari, dar de multe ori au avut de suferit din limitele de prejudecata-condus de cercetare. Metabolitul profilului poate fi, de asemenea, utilizate pentru a evalua variaţia genotipică, fără a fi necesară dezvoltarea prealabilă a instrumente moleculare pentru o anumită specie[4, 57]. Ne putem aştepta de profile metabolitului să devină un instrument-cheie într-o varietate de domenii, în anii care vin.

Referinte

1. Weckwerth W: metabolomica în sistemele de biologie.

   Annu Rev Plant Biol 2003, 54 :. 669-689

2. Chace DH: spectrometrie de masa, in laborator clinic.

   Chem Rev 2001, 101 : 445-477.

3. Trethewey RN, Krotzky AJ, Willmitzer L: profiluri metabolice: O Rosetta Stone pentru genomica?

   Pac aviz din plante Biol 1999, 2 :. 83-85

4. Fiehn O, Kopka J, Dörmann P, T Altmann, Trethewey RN, Willmitzer L: profile Metabolit pentru genomica plantelor funcţionale.

   Nat Biotechnol 2000, 18 :. 1157-1161

5. LW Sumner, Mendes P, Dixon RA: metabolomica Plant: fitochimiei pe scară largă în epoca genomica functionala.

   Fitochimie 2003, 62 :. 817-836

6. Birkemeyer C, Kolasa A, Kopka J: derivatizare chimice de zboruri pentru cromatografia de gaze-spectrometria de masă pe bază multi-ţintă, profilarea fitohormoni majore.

   J Chromatogr A 2003, 993 : 89-102.

7. Un Mueller, Duechting P, Weiler EW: Un multiplex tehnica GC-MS/MS pentru sensibile şi cantitative single-rula analiza de fitohormoni acide şi a compuşilor înrudiţi, iar aplicarea sa la Arabidopsis thaliana.

   Planta 2002, 216 :. 44-56

8. Knapp DR: Manualul de derivatizare Reacţii analitice. New York: John Wiley & Sons, 1979.

9. Wagner C, Sefkow M, Kopka J: Construirea şi punerea în aplicare a unui spectrale de masă şi de retenţie timp de baze de date indicele provenite din plante GC / EI-TOF-MS profile metabolit.

   Fitochimie 2003, 62 :. 887-900

10. van Deursen MM, Beens J, Janssen HG, Leclercq PA, Cramers CA: Evaluarea de detecţie masă timp-de-zbor spectrometrice pentru cromatografie în fază gazoasă rapid.

    J Chromatogr A 2000, 878 : 205-213.

11. Roessner U, Luedemann A, D Brust, Fiehn O, Linke T, Willmitzer L, Fernie AR: profile metabolice permite fenotipului amplă a sistemelor de plante modificate genetic sau de mediu.

    Plant Cell 2001, 13 :. 11-29

12. Roessner U, C Wagner, Kopka J, Trethewey RN, Willmitzer L: avans tehnice: analiza simultana a metaboliţilor în tuberculului de cartof prin cromatografie de gaz-spectrometrie de masă.

    Plant J 2000, 23 : 131-142.

13. Dole M, Mack LL, Hines RL: grinzi de macroions moleculară.

    J Chem Fiz 1968, 49 : 2240-2249. Textul integral al editorului

14. Yamashita M, Fenn JB: electrospray ion-sursă - o altă variaţie pe tema liber-jet.

    J Fiz Chem 1984, 88 : 4451-4459.

15. Zabrouskov V, Giacomelli L, van Wijk KJ, McLafferty FW: O nouă abordare pentru proteomica a plantelor - caracterizarea de proteine cloroplast de Arabidopsis thaliana prin spectrometrie de masă de sus în jos.

    Mol Proteomics Cell 2003, 2 : 1253-1260.

16. Karst U: tehnici de detecţie pentru cromatografia lichidă.

    Anal Bioanal Chem 2002, 372 :. 27-28

17. Jennings KR: Impactul schimbare a descompunerii coliziune induse de ioni pe spectrometrie de masa.

    Int J Mass Spectrom 2000, 200 : 479-493.

18. Stafford G: Ion spectrometrie de masă capcană: o perspectivă personală.

    J Am Soc Mass Spectrom 2002, 13 :. 589-599

19. Niessen WMA: de stat-of-the-art în lichid cromatografie-spectrometrie de masă.

    J Chromatogr A 1999, 856 : 179-197.

20. Hughey CA, Rodgers RP, Marshall AG: Rezoluţia de 11.000 componente compozitional distincte într-un singur electrospray ionizare Fourier transforma ion ciclotron spectru de masă de rezonanţă a ţiţeiului.

    Anal Chem 2002, 74 :. 4145-4149

21. Tanaka N, Kobayashi H: coloane monolitic pentru cromatografia lichidă.

    Anal Bioanal Chem 2003, 376 :. 298-301

22. Tolstikov VV, Lommen A, K Nakanishi, Tanaka N, O Fiehn: monolitic pe bază de siliciu capilară fază inversă cromatografie lichidă / electrospray spectrometrie de masa pentru metabolomica de plante.

    Anal Chem 2003, 75 :. 6737-6740

23. Stein SE: O metodă integrată pentru extracţie şi de identificare a spectrului de frecvenţe compus din datele de spectrometrie de gaz cromatografie / de masă.

    J Am Soc Mass Spectrom 1999, 10 : 770-781. Textul integral al editorului

24. Tong CS, Cheng KC: metoda de masă căutare spectrale folosind metoda reţele neuronale.

    Chemometrics intell Lab Syst 1999, 49 : 135-150.

25. Tolstikov VV, Fiehn O: Analiza de compuşi puternic polari de origine vegetală: Amestec de cromatografie interacţiune hidrofile şi ioni de masă electrospray spectrometrie de capcană.

    Anal Biochem 2002, 301 :. 298-307

26. Sala R, M Beale, Fiehn O, N Hardy, Sumner L, Bino R: metabolomica Plant: veriga lipsa dintre genotip şi fenotip.

    Plant Cell 2002, 14 : 1437-1440.

27. Ratcliffe RG, Shacher-Hill Y: Probing metabolismul plantelor cu RMN.

    Annu Rev Plante Physiol Plante Mol Biol 2001, 52 :. 499-526

28. Bligny R, Douce R: RMN si a plantelor metabolismul.

    Pac aviz din plante Biol 2001, 4 :. 191-196

29. Noteborn HPJM, Lommen A, van der Jagt RC, Wewsemna JM: amprentarea chimice pentru evaluarea neintenţionate modificări metabolice secundare în culturile alimentare transgenice.

    J Biotechnol 2000, 77 :. 103-114

30. Fan twm, Higashi RM, Lane AN: Monitorizarea metabolismului hipoxice în ţesutul plantei de superfused in vivo H-1-RMN.

    Arch Biochem Biophys 1986, 251 :. 674-687

31. Guta E, Bligny R, N Pascal, Douce R: C-13-magnetică nucleară studii de rezonanţă maleat şi sinteza citrat şi compartimentarea în celulele plantelor superioare.

    J Biol Chem 1993, 268 :. 3986-3992

32. Sessa RA, Bennett MH, Lewis MJ, Mansfield JW, Beale MH: profilarea metabolit al lactone sesquiterpene din Lactura specii. Componentelor majore din latex sunt oxalat de noi şi conjugaţi sulfat de lactucin şi a derivatelor sale.

    J Biol Chem 2000, 275 :. 26877-26884

33. Hanson AD, Roje S: One-carbon metabolismului în plante superioare.

    Annu Rev Plante Physiol Plante Mol Biol 2001, 52 :. 119-137

34. Hole SJW, Howe PWA, Stanley PD, Hadfield ST: recunoaşterea analiza Forma de metaboliţi celule endogene pentru modul de transfer mare de acţiune de identificare: eliminarea dilema postscreening asociate cu întregul organism de screening-tranzitată de mare.

    J Biomol Ecranul 2000, 5 : 335-342.

35. Fernie AR: caracterizarea Metabolome în analiza de sistem a plantelor.

    Funct Plant Biol 2003, 30 : 111-120. Textul integral al editorului

36. Bergmeyer HU, Ed: Metode de analiză enzimatică. VCH, Weinheim, Germania; 1987

37. Gibon Y, Vigeolas H, Tiessen A, Geigenberger P, Stitt M: sensibilă şi de înaltă teste tranziteaza metabolit pentru pirofosfat anorganice, fosfaţi ADPGlc, nucleotidici, şi intermediari glycolytic bazează pe un sistem nou de ciclism enzimatice.

    Plant J 2002, 30 : 221-235.

38. Van Schaftingen E: D-fructoză 2,6-bifosfat. În metodelor de analiză enzimatică. volum 6. 4-a ediţie. Editat de Bergmeyer HU. Weinheim: VCH; 335-341.

39. Blázquez MA, Gancedo JM, Gancedo C: Utilizarea Yarrowia lipolytica hexokinazei pentru determinarea cantitativă a trehaloză 6-fosfat.

    FEMS Microbiol Lett 1994, 121 :. 223-227

40. Häusler RE, Fischer KL, Flügge UI: Determinarea de low-abundente metaboliţii din extractele de plante de către DNA (P) H fluorescenţă cu un cititor de placă microtiter.

    Anal Biochem 2000, 281 :. 1-8

41. McElroy KE, Bouchard PJ, Harpel MR, Horiuchi KY, Rogers KC, DJ Murphy, Chung TDY, Copeland RA: Punerea în aplicare a unui continuu, o enzimă-cuplate test de fluorescenta pentru high-throughput analiza de glutamat producătoare de enzime.

    Anal Biochem 2000, 284 :. 382-387

42. Deshpande SS: Principii si aplicatii de spectroscopie luminiscenta.

    Crit Rev alimentare Sci Nutr 2001, 41 : 155-224.

43. Stitt M, Fernie AR: Din măsurătorile de metaboliţi la metabolomica: o "din zbor" perspectiva ilustrate prin studii recente de carbon-azot interacţiuni.

    Pac Biotechnol aviz din 2003, 14 :. 136-144

44. Sundberg SA: transfer de înaltă şi ultra-înaltă de screening tranziteaza: soluţie-şi celule pe baza de abordări.

    Pac Biotechnol aviz din 2000, 11 :. 47-53

45. Hadd AG, Raymond DE, JW Halliwell, SC Jacobson, Ramsey JM: dispozitiv Microchip pentru efectuarea testelor de enzime.

    Anal Chem 1997, 69 :. 3407-3412

46. Hong JW, Quake SR: Sistemele integrate de nanoliter.

    Nat Biotechnol 2003, 21 :. 1179-1183

47. Roessner Tunali-U, Hegemann B, Lytovchenko A, F Carrari, Bruedigam C, D Granot, Fernie AR: profilului metabolic al plantelor transgenice de tomate exces hexokinazei relevă că influenţa fosforilarea hexoze diminueaza in timpul dezvoltarii de fructe.

    Plant Physiol 2003, 133 :. 84-99

48. KEGG [ftp://ftp.genome.ad.jp/pub/kegg/ligand/] webcite

49. Mueller LA, Zhang PF, Rhee SY: AraCyc: o bază de date cale biochimice pentru Arabidopsis.

    Plant Physiol 2003, 132 :. 453-460

50. AraCyc [http://www.arabidopsis.org/tools/aracyc/] webcite

51. Thimm O, O Bläsing, Gibon Y, Nagel A, Meyer S, P Krüger, Selbig J, Müller LA, Rhee SY, Stitt M: MapMan: Un instrument axată pe utilizator pentru a afişa seturi de genomica de date pe diagrame de căi metabolice şi biologice alte procese.

    Plant J 2004, 37 : 914-939.

52. MapMan [http://gabi.rzpd.de/ImageAnnotator.html] webcite

53. Urbanczyk-Wochniak E, Luedemann A, Kopka J, Selbig J, Roessner Tunali-U, Willmitzer L, Fernie AR: analiză paralelă a transcriere şi profiluri metabolice: o nouă abordare în biologie sisteme.

    EMBO Rep 2003, 4 :. 989-993

54. Weckwerth W, Wenzel K, Fiehn O: Procesul pentru integrate de extracţie, identificarea şi cuantificarea metaboliţilor, proteine si ARN-ului pentru a descoperi lor de co-reglementarea in retelele biochimice.

    Proteomica 2004, 4 :. 78-83

55. Tiessen A, Hendriks JHM, Stitt M, Brausheid A, Gibon Y, Farre EM, Geigenberger P: sinteza amidon din tuberculii de cartof este reglementată de post-translaţionale modificarea redox de ADPglucose pyrophosphorylase: un mecanism nou de reglementare care leagă sinteză amidon la sursa de zaharoză.

    Plant Cell 2002, 14 : 2191-2213.

56. Trethewey RN: descoperirea genelor prin profilarea metabolit.

    Pac Biotechnol aviz din 2001, 12 :. 135-138

57. Roessner U, Willmitzer L, Fernie AR: profiluri metabolice şi biochimice ale fenotipului sistemelor de plante.

    Celulelor plantelor Rep 2001, 21 : 189-196.