Disecţie circuitele de reglementare a genomului eucariote

"Whitehead Institutul de Cercetare biomedicala
Cambridge, Massachusetts 02142
t Departamentul de Biologie
Massachusetts Institute of Technology
Cambridge, Massachusetts 02139
* Institutul Medical Howard Hughes
Programul în Medicina Moleculara
Universitatea din Massachusetts Medical Center
Worcester, Massachusetts 01605
§ Dana-Farber Cancer Institute si
Harvard Medical School
Boston, Massachusetts 02115

Rezumat

Genome analiza întregului exprimare a fost utilizat pentru a identifica gene a caror expresie depinde de funcţiile de componente cheie ale maşinilor iniţiere transcrierea în drojdie. Componente ale ARN polimerazei holoenzyme al II-lea, general de transcriere TFIID factor, iar complexul SAGA cromatina Modificari s-au dovedit a avea roluri în expresie de seturi distincte de gene. Rezultatele arată un nivel neprevazute de regulament, care este suprapusă pe faptul că, datorită genelor specifice factori de transcriptie, un mecanism nou de reglementare a coordona de seturi specifice de gene, atunci cand celulele se confruntă limitator de substante nutritive, precum şi dovada că obiectivele final de calea de transducţie semnal poate fi identificate în cadrul aparatului de iniţiere.

Introducere

O mare parte din regulament biologice are loc la nivel de iniţiere transcriere. Genele conţin secvenţe de promotor, care sunt obligate prin transcriptie activatori şi de represiune-sors (Struhl, 1995; Ptashne şi Gann, 1997). Activatori recruta maşini de iniţiere transcriere, care, pentru proteine-gene care codeaza compune din polimerazei ARN al II-lea şi cel puţin 50 de componente suplimentare (Orphanides et al, 1996;. Roeder, 1996; Greenblatt, 1997; Hampsey, 1998; Myer şi tânăr, 1998). Maşini de iniţiere include factori de transcriere care se leaga de ADN, de ciclin-înregis-Dent kinaze care reglementează activitatea polimerazei, şi as-tylases si a altor enzime care modifică cromatinei (Burley şi Roeder, 1996; Kingston Etal, 1996;. Roth şi Allis, 1996 ; Steger şi Workman, 1996; Tsukiyama şi Wu, 1997; Hengartner et al, 1998;. Struhl, 1998).

¹¹ Pentru cine corespondenţă ar trebui să fie abordate (e-mail: @ mici wi.mit.edu ).

Intelegerea noastra a expresiei genice eucariote rămâne limitată în mai multe moduri. Set complet de tran-scriptional autorităţile de reglementare nu a fost încă identificate. Modul în care aceste interacţiona cu autorităţile de reglementare şi de a reglementa componente ale maşinilor transcriptie nu este încă clar. Funcţiile ofjust o fracţiune de componente ale maşinilor transcriptie sunt înţelese, şi atunci numai cu privire la un set mic de gene. Celulele trebuie să se adapteze expresia genomului pentru a se adapta schimbărilor din mediul lor şi în programele lor de control creştere şi dezvoltare, dar exact modul de exprimare a coordona remodelare genomului se realizează pentru semnal transduc-TION cai sau pentru celula de ceas ciclu a fost încă să fie învăţate.

Genome de monitorizare la nivel de expresie a devenit de curand posibil cu descrierea completa a genomului de secvenţe şi prin dezvoltarea de tehnologie ADNc şi de înaltă densitate matrice oligonucleotidului (Chee et al, 1996;. Lockhartet al, 1996;. DeRisi Etal, 1997;. Lash Kari-Etal, 1997;. Wodickaetal, 1997).. Profile expresie a fost utilizat pentru a examina diferentele in expresia genelor atunci când drojdie sunt cultivate în diverse medii (Wodicka Etal, 1997.), Şi a arătat cât de expresie a genomului de drojdie este remodelata in timpul trecerea metabolice din fermentare la respiraţie (DeRisi et al., 1997) şi în timpul ciclului celular (Cho et al, 1998.). Profile expresie este, de asemenea, utilizat pentru a îmbunătăţi înţelegerea noastră a diferitelor aspecte ale biologiei umane si a bolii (DeRisi et al, 1996;.. Schena et al, 1996) şi pentru a facilita dezvoltarea de droguri (Gray et al, 1998.). Datele generate cu genomului la nivel de tehnologie de monitorizare expresie descrie nivelul din fiecare specie mRNA într-o populaţie, dar numai aceste date nu produce întotdeauna importante perspective noi biologice. Cunoştinţele noastre de genomului la nivel de tran-scriptional regulament sunt incomplete, ceea ce face dificil de înţeles modul în care astfel de genomului la nivel de semnături expresie transpira.

Suntem explorarea capacităţii de analiză a genomului la nivel de exprimare pentru a oferi perspective în circuitele de reglementare transcriptie a celulelor eucariote. Un astfel de studiu ar trebui să ofere fundamentul şi contextul pentru interpretarea studiile mecaniciste în controlul de expresia genelor. O abordare a acestei probleme este de a identifica un set de gene reglementate de fiecare promotor-obligatoriu factor de transcriere. Cu toate acestea, în cazul în care aparatul de iniţiere transcriere în sine joacă un rol important in reglarea expresiei genice, atunci este important să se determine măsura în care fiecare gena in genomul depinde de funcţia de componentele-cheie ale maşini de transcriere pentru exprimarea ei. Vom descrie aici mARN populaţia de celule de drojdie, cerinţa pentru componentele-cheie ale maşinilor transcriptie în expresie a acestei populaţii, observaţia că anumite componente ale aparatului generale sunt ele însele reglementate atunci când celulele se confruntă limitator de substante nutritive, dovada că obiectivele final de semnal calea de transducţie pot fi identificate în cadrul aparatului de iniţiere, şi perspective suplimentare in genomului la nivel de circuit de reglementare. Este bine cunoscut faptul că, în eucariote transcriptie de control este în mare parte datorită acţiunii combinatoriale de promotor specifice activatori de la promotori şi promotori. Rezultatele noastre arată că factorii de transcriptie generale adaugă un nivel suplimentar de control combinatorii de expresia genelor eucariote.

Rezultate

Caracteristici ale studiului

Studiul a descris aici a fost proiectat pentru a evalua obligaţia pentru componentele-cheie ale ARN polimerazei maşini de transcriptie al II-lea. Acest lucru a fost realizat prin utilizarea de inalta densitate matrice oligonucleotidului (HDAs) (Wo-dicka et al., 1997) pentru a determina efectele mutatii in genomul larg aceste componente. Informaţii detaliate şi baze de date suport pentru toate aspectele legate de acest studiu pot fi găsite pe World Wide Web la http://www.wi.mit.edu/tineri/expression.html.

Drojdie transcriptomului

Cunoaşterea nivelurilor de toate speciile mRNA detectabile în drojdie de bere este folositoare pentru a evalua gradul în care aceste niveluri depind cu privire la orice component al aparatului transcriere. Pentru a obţine această informaţie şi pentru a evalua reproductibilitatea tehnologia HDA, ARN-ul a fost recoltat de la două independente de tip sălbatic culturi şi comparate utilizând două seturi de HDAs la 2 zile separate. HDAs utilizate aici pot înscrie nivelurile mRNA pentru până la 6181 gene. Din 5460 gene ale căror niveluri de mRNA au fost determinate cu exactitate şi comparate în ambele experimente, 99% din mRNAs diferă nu mai mult de 1,7 ori, şi doar 35 transcrierile (0,65%) au prezentat mai mult decât o schimbare de 2 ori. Pentru a preveni aceste variaţii minime de a influenţa rezultatele, toate experimentele au fost efectuate în dublu exemplar. Nivelurile stabilite pentru 5460 transcrierile în celule de drojdie de tip sălbatic şi informaţii suplimentare obţinute de la acest experiment pot fi găsite în cadrul populaţiei mRNA Drojdie de pe site-ul web. Metoda SAGE a fost utilizat anterior pentru a determina valorile pentru 4465 transcrieri, al cărei rezultat a fost numit transcriptomului de drojdie (Velculescu et al., 1997). Sensibilitatea a tehnologiei HDA permis o determinare a nivelurilor de multe produse gene suplimentare şi a arătat că transcrierile de la 80% din gene drojdie exprimate există la niveluri de 0,1 până la 2 molecule / celulă.

Dependenţa de exprimare Genome privind componentele-cheie ale Machinery transcriptie

În orice promotor unul, maşini de transcriptie ar putea include ARN-polimerazei II de bază de enzime, factori de transcriere generală (GTFs), SRB core / medi-ator complex, Srb10 CDK complex, complex SWI / SNF, şi complexul SAGA, printre altele (Figura 1). Unul sau mai multe subunităţi de fiecare dintre aceste componente a fost investigat pentru rolul său în expresia genelor la nivelul genomului prin utilizarea de mutatii care afecteaza fie funcţia sau prezenţa fizică a subunităţi (Tabelul 1). Pierdere-de-mutatii in funcţie de diversele componente ale aparatului de transcriere au fost construite sau obţinute de la anchetatorii diferite (a se vedea Studiu de design de pe site-ul web pentru detalii). Două tipuri de mutatii s-au dovedit a fi utile în acest studiu. Pentru componentele esenţiale ale aparatului, sensibile la temperatură (TS) mutaţii sunt valoroase, deoarece acestea permit cercetătorului să examineze efectele asupra expresia genelor în orice moment după inactivarea factor. Pentru componentele neesenţiale, ne-am folosit, fie mutaţii punctiforme, care knock out funcţia catalitică a activităţilor enzimatice cunoscute, sau mutaţii ştergerea completă. În fiecare experiment, o celulă mutant şi a izogenice de tip sălbatic omologul sunt cultivate la jumătatea-log fază, cele două populaţii sunt recoltate, ARN-ul este pregătit, şi hibridare a HDAs se efectuează, toate în dublu exemplar.

Figura 1. Model de ARN-polimerazei II Maşini de transcriere Iniţierea

Maşini de descris aici cuprinde peste 85 de polipeptide din zece (sub) Complexe: miez ARN-polimerazei II (RNAPII) constă din 12 subunitati; TFIIH, 9 subunitati; TFIIE, 2 subunitati; TFIIF, 3 subunitati; TFIIB, 1 subunităţi; TFIID, 14 subunitati; miez SRB / mediator, mai mult de 16 subunitati; SWI / SNF complex, 11 subunitati; Srb10 complexe kinazei, 4 subunitati, şi SAGA, 13 subunităţi (a se vedea site-ul web pentru mai multe detalii). Cum este detaliat în tabelul 1, subunităţi reprezentative din aceste complexe au fost alese pentru o analiză a dependenţei transcriere genomului la nivel.

Dependenţa de Core polimerazei ARN al II-lea

Pentru a determina dependenta genomului la nivel de expresia genelor pe bază polimerazei ARN al II-lea, ARN a fost izolat dintr-o celulă rpb1-1 lingurita si sa tip sălbatic omologul 45 min după o schimbare de temperatura nonpermissive şi a fost hibridizat la HDAs. Deoarece rpb1-1 celule oprirea transcriere de proteine-gene care codeaza imediat după o schimbare de temperatură, aceste celule au fost folosite de către noi şi alte anchetatori pentru a determina timpul de înjumătăţire de mRNAs drojdie diverse (Nonet et al, 1987;. Herrick et al, 1990).. 45 min timp punctul a fost utilizat pentru analiza de toti mutantii ts în acest studiu, deoarece este suficient de lungă pentru a detecta o reducere semnificativă (de exemplu, de 2 ori sau mai mult), pierderea de nivelurile mRNA pentru 94% din produse de gena detectabil, fără nici o pierdere de rRNA (Nonet et al., 1987). În plus, punctul 45 de minute de timp este suficient de scurt pentru a reduce la minimum efectele potenţial complicând de arestare ciclului celular si moartea celulelor.

Rezultatele genomului analiza întregului expresie a mutante rpb1-1 în comparaţie cu o izogenice sălbatic de tip suşă sunt prezentate într-un format grilă în Figura 2A. Grila prezinta schimbarea în nivelul de mRNA pentru fiecare gena, începând cu cea mai din stânga-gena de pe cromozomul I şi proces-verbal într-un mod liniar, la stânga la dreapta, prin intermediul cromozomului I, apoi II, apoi III, etc, până la ultimul gena pe braţul drept al cromozomului al XVI-lea se ajunge la cea mai mică din dreapta sus. Marcate în această analiză au fost

Tabelul 1. Maşini transcriptie

* Rezultate Srb4 şi Kin28 au fost în esenţă, identice cu Rpb1, dar din cauza rigoarea aplicate de algoritm se potrivesc, o estimare minimă este produsă.

5735 gene. Marea majoritate a mRNAs sunt reduse mai mult de 2 ori în celulele mutante relativ la sălbatic de tip celule, iar acest lucru oferă o reducere aparent de înjumătăţire pentru fiecare dintre speciile mARN (a se vedea mRNA Populaţia Drojdie de pe site-ul web). Valoarea determinată cu această abordare este o aproximare, dar este util pentru scopuri comparative. Compararea acestor date cu cele obţinute de un alt factor TS identifică set de gene a caror expresie este echivalent depinde de polimerazei ARN al II-lea şi a factorului de interes.

Există un set de gene ale căror mRNAs nu sunt semnificativ reduse in celulele mutante. Acestea constau din gene, care au mesaje stabile, precum şi genele ale căror mRNA niveluri sunt usor crescute în celulele mutante relativ la tipul sălbatic. În acest din urmă grup sunt multe de şoc termic este cunoscută sau gene raspuns de stres (de exemplu, SSA4, SSA3, HSP26, HSP30, HSP42, şi SSL2), plus ORFS suplimentare de functie necunoscuta, dar, probabil, legate. Rezultate similare au fost obţinute folosind mutanti ts în alţi factori de transcriptie generale.

Dependenţa de SRB / subunităţi Core Moderator complex SRB / mediator este strâns asociat cu ARN-polimerazei II, într-un complex care a fost numit holoenzyme (Kim et al, 1994;. Koleske şi tânăr, 1994). Srb4 este o componentă esenţială a complexului SRB / mass-media-tor (Kim et al, 1994; Hengartner et al, 1995;. Thompson şi Young, 1995). Un mutant TS în Srb4 (srb4-138) a fost utilizată anterior pentru a obţine probe că mai multe proteine-gene care codeaza necesită funcţia de Srb4 şi sunt astfel susceptibile de a avea forma holoenzyme de ARN-polimerazei II recrutaţi pentru a promotorilor lor (Thompson şi Young, 1995 ). Genome analiza întregului exprimare oferă un test mai riguroasă a modelului pe care expresia de toate genele care codifica diferite proteine ​​este dependentă de Srb4. Experimentul a fost efectuat cu acelaşi protocol utilizat cu TS Rpb1 mutant. Din 5361 gene a caror mRNA niveluri de exprimare ar putea fi comparate (de exemplu, cele care au avut o scădere mai mare de 2 ori într-un experiment cu Rpb1 ts şi au fost marcate într-un experiment Srb4 TS),

93% au înregistrat o scădere care se potrivesc îndeaproape scăderea observată în experiment TS Rpb1. Dintre mRNAs care nu se potriveau îndeaproape degradare ts Rpb1, numai două au putut fi găsite au arătat că reproductibile diferenţe mari în decăderea lor în cele două experimente efectuate. În plus, un set de gene ale căror mRNAs nu sunt semnificativ reduse în TS Rpb1 mutant manifestă acelaşi comportament în experiment TS Srb4. Rezultatele indică faptul că genomul-larg expresie este la fel de dependentă de Srb4 cum este pe bază polimerazei ARN-al II-lea (a se vedea Genome-Wide Date Exprimarea pe site-ul web pentru detalii). Deoarece Srb4 este asociată strâns şi exclusiv cu ARN poli-merase holoenzyme II (Kim et al, 1994;. Koleske şi tânăr, 1994;. Myers et al, 1998), putem deduce că Srb4 care conţin ARN-polimerazei holoenzyme II este în general, necesare pentru transcriere.

Med6 este o altă componentă esenţială a complexului SRB / medi-ator şi pare să fie fizic asociat cu Srb4 (Li, et al 1995;. Lee et al, 1998;. Myers et al, 1998.). O Med6 ts mutant a fost generate şi utilizate pentru a demonstra că Med6 este necesar pentru inducerea completă a GAL, SUC2, MFA1, şi PYK1 gene, dar nu este necesar pentru exprimarea de multe altele (Lee et al., 1997). Dependenţa genomului la nivel de expresia genelor pe Med6 a fost determinată cu această tulpină ts Med6 aşa cum este descris mai sus pentru Rpb1. Rezultatele indică faptul că expresia de 10% din gene drojdie sunt la fel de dependente de Med6 astfel cum acestea sunt pe Rpb1 (Figura 2B, vezi site-ul web pentru informatii detaliate).

Reducerea nivelului mRNA observate în mutanti TS la scurt timp după o schimbare de temperatură (de exemplu, 45 min), este probabil o consecinta a efectelor primare din cauza factorului inactiva-TION, deoarece timpul necesar pentru a produce mostsecond-are efecte implică o reducere substanţială atât în ​​cadrul unui transcrierea şi a produsului său de traducere. Cu toate acestea, rezultatele obţinute în acest tip de experiment trebuie să fie considerată ca suma efectelor primare şi secundare. Pentru a identifica un set de gene a căror schimbare în expresie este cel mai probabil, o consecinţă directă a pierderii funcţiei factorului de TS, am compara datele de la inactivarea ts

Figura 2. Genome-Wide de date de expresii pentru componentele selectate de ARN-ului polimerizare în Holoenzyme al II-lea

Date care să reflecte schimbările în nivelurile de mRNA atunci când un mutant este comparat sale izogenice sălbatic de tip omologul este prezentat într-un format grilă. În grila, grila pătrat sus stânga reprezintă cea mai din stânga gena de pe cromozomul-I, precum şi dreptul său de pătrate pentru a reprezenta gene adiacente, proces-verbal într-un mod liniar, prin intermediul cromozomului I, apoi II, apoi III, etc, până la ultimul genei pe braţul drept al cromozomului al XVI-lea este atinsă la partea de jos a grilei. Rezultatele sunt afişate pentru (A) Rpb1, (B) Med6, (C) Srb10, şi (D) Swi2.

de ARN-polimerazei II cu cea obţinută prin ts inactiva în aplicare a orice alt factor. Compararea a două seturi de date relevă transcrierile cu cinetică cariilor echivalent în rpb1-1 şi alte mutanta TS (a se vedea Technology, protocoalele, şi analiză a datelor de pe site-ul web pentru detalii). Pentru cei gene afectate de întrerupere a ts Med6 în cazul în care o astfel de comparaţie ar putea fi, mRNAs de gene 506 a scăzut cu cinetica similare din Med6 şi Rpb1 experimente. Astfel, expresia de 10% din gene drojdie sunt la fel de dependente de Med6 astfel cum acestea sunt pe Rpb1. Aceste gene 506 sunt cele mai susceptibile de a avea o cerinţă directă pentru Med6 funcţie. Transcrierea gene a caror niveluri nu se potrivesc cinetica Rpb1 ar putea avea un impact direct, dar parţial, cerinţa pentru Med6 funcţie, sau efectele observate la aceste gene sunt o consecinţă secundară a unor gene altor niveluri modificate mRNA. Genele 506 le-am identificat care necesită Med6 funcţie în aceeaşi măsură ca Rpb1 funcţie sunt cele la care promotor-asociate reglementare transcriptie sunt cel mai probabil să funcţioneze prin interacţiuni cu Med6.

Srb5 este o componentă a complexului SRB / mediator a căror funcţie nu este, de asemenea, cunoscut (Thompson et al, 1993;. Kim et al, 1994;. Koleske şi tânăr, 1994; Hen-Gartner et al, 1995;. Myers et al., 1998). Pentru a determina dependenta genomului la nivel de expresia genelor pe Srb5, o suşă lipsa unei SRB5 genă şi ei de tip sălbatic omologul au fost comparate (a se vedea site-ul web pentru informatii detaliate). Rezultatele indica faptul ca 16% din toate genele necesită Srb5 funcţia lor de exprimare. Cu SRB5 tulpina text eliminat şi cu ceilalţi mutanţi constitutive

analizate aici, nu este posibil să se facă distincţia între rezultate care sunt o consecinţă directă a pierderii functiei de Srb5 şi cele care se datorează unui efect secundar, cum ar fi pierderea unui alt regulator de transcriptie. Cu toate acestea, aceste rezultate oferă informaţii importante în măsura în care dezvăluie set complet de gene care sunt direct sau indirect afectate de pierderea de Srb5 funcţiei. A fost surprinzător faptul că expresia de gene mai multe centrale de la calea de răspuns feromoni sunt dramatic afectate de pierderea de Srb5, aşa cum sa discutat de mai jos.

Dependenţa de Srb10 CDK Complexul Srb10 este ciclin-dependent Kinază, care este parte dintr-un subcomplex holoenzyme care conţin Srb8, -9, -10, -11 şi proteine ​​(Hengartner et al, 1995;.. Liao et al, 1995). Srb10 si proteinele asociate acesteia au fost propuse pentru a forma un complex negativ de reglementare care funcţionează prin intermediul fosforilarea ARN polimerazei II CTD (Hen-Gartner et al., 1998). Pentru a determina modul în care expresia genelor depinde de Srb10, ARN-ul a fost izolat de la un punct de Srb10 mutante care nu are activitate catalitică, iar profilul de exprimare a fost comparată cu cea a sale de tip sălbatic omologul. Rezultatele sunt prezentate într-un format grilă în figura 2C. Din 5626 gene care au fost marcate, 173 produse de gena au înregistrat creşteri de 2 ori sau mai mare în nivelurile de mRNA în mutant relativ la tipul sălbatic. Acest lucru indică faptul că Srb10 este în mod normal un regulator negativ al acestor 173 gene (aproximativ 3% din genomul). Aşa cum sa discutat mai jos, este de remarcat faptul că aproape jumătate din aceste gene sunt derepressed timpul privarea de nutrienţi.

Dependenţa de SWI / SNF

Activitatea Swi2 ATPase joacă un rol esenţial în capacitatea complexului SWI / SNF de a remodela cromatinei (Khavari Etal, 1993;. Laurent et al, 1993;.. Coasta de et al, 1994). Această activitate este gandit pentru a facilita şi de activator de aparate de transcriere cu caracter obligatoriu pentru regiunile promotor pentru un număr mic de gene, depăşind astfel represiunea de Nucleo-Somes, la cele promotori (Cote et al, 1994;. Imbalzano et al, 1994;. Kwon et al., 1994; Burns şi Peterson, 1997). În consecinţă, am anticipat faptul că un număr mic de gene ar putea fi redus în nivelurile de expresie în mutant Swi2/Snf2. Pentru a determina dependenta genomului la nivel de expresia genelor la nivelul complexului SWI / SNF, ARN-ul a fost izolat din punct de Swi2/Snf2 un mutant care nu are activitate şi a ATP-aza de tip sălbatic de contrapartidă, şi două preparate ARN-ul au fost hibridizate la HDAs. Rezultatul a fost surprinzător faptul că un număr mai mare de gene par a fi negativ reglementate de SWI / SNF decât cele care sunt reglementate pozitiv (Figura 2D, vezi site-ul web pentru informatii detaliate). Datele arată că 203 produse de gena au fost crescute de 2 ori sau mai mult în raport mutanta la tipul sălbatic, în timp ce doar 126 transcrieri a scăzut de 2 ori sau mai mult (a se vedea Genome-Wide Date Exprimarea pe site-ul web). După cum este descris mai jos, acest rezultat poate fi explicat prin date recente care indică faptul că complexul de SWI / SNF pot cataliza remodelarea cromatinei în orice direcţie (Schnitzler et al, 1998.).

Dependenţa de factori de transcriptie General factori de transcriere generale sunt necesare pentru a reconstitui promotor-dependente de transcriere in vitro cu miez de ARN-polimerazei II. Acesti factori includ TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIE, şi TFIIH. Printre aceşti factori, TFIIE şi TFIIH sunt de interes special, deoarece numeroase rapoarte au sugerat că acestea sunt, de fapt, nu, în general, necesare pentru expresia genelor (Parvin et al, 1992;. Serizawa Etal, 1993;. Timmers, 1994; Holstege et al, 1995;. Kuldell şi Buratowski, 1997; Sakurai et al, 1997;. Tijerina şi Sayre, 1998). Genome analiza întregului expresie a fost efectuat pe o celulă TS Kin28 şi a izogenice sălbatic de tip omologul utilizând acelaşi protocol experimental utilizat pentru Rpb1 TS mutant. Kin28, o subunitate de CDK TFIIH, este o ARN-polimerazei II kinaza CTD că este implicat în tranziţia de la iniţiere la alungire (Dahmus, 1996). Rezultatele arată thatKin28 este, în general, necesar pentru exprimarea de proteine-gene care codeaza (a se vedea Genome-Wide Date Exprimarea pe site-ul web). TFIIE este gandit pentru a facilita anumite funcţii ale TFIIH. În contrast cu rezultatele obţinute cu Kin28, analiza a genomului la nivel de expresie, cu o TS Tfa1 mutant arată că doar 54% din gene drojdie necesită cea mai mare subunitate a TFIIE în aceeaşi măsură ca nucleu ARN-polimerazei II (a se vedea Genome-Wide de date Expression pe site-ul web).

Factorii TBP-asociate (TAF _II e) din TFIID sunt deosebit de interesante, deoarece acestea au fost postulate pentru a juca un rol important in selectivităţii promotor şi activarea genei (Burley şi Roeder, 1996; Verrijzer şi Tjian, 1996; Lee şi tânăr, 1998). O mutaţie ts în TFIID subunitatea TAF _II 145 (Walker et al., 1997) a fost utilizată pentru a determina dependenţa genomului la nivel de expresia genelor pe această TAF. Din 5441 gene care au fost marcate, produse de gena 1618 s-au redus de 2 ori sau mai mare, în medie, în cele două comparaţii făcute după 45 min schimbare de temperatură. Pentru acele gene în cazul în care o comparaţie cu experimentul Rpb1 ar putea fi făcute, 16% au arătat o dependenţă pe TAF _II- 145, care a fost similară cu dependenţa lor pe Rpb1 (a se vedea Genome-Wide Date Exprimarea pe site-ul web pentru detalii). Interesant, un numar mare de gene implicate în funcţiile asociate cu progresia prin intermediul ciclului celular sunt printre cele mai multe gene susceptibile de a avea o cerinţă directă pentru TAFII145 funcţie. TAFII145 ts mutant are un fenotip ciclului celular: o creştere arestări în G1-S după celulele sunt transferate la temperatura nonpermis-excesivă. Studii anterioare au aratat ca mai multe gene G1-S cyclin sunt exprimate la niveluri reduse în aceste celule, probabil de contabilitate pentru fenotipului arestare ciclului celular (Walker et al., 1997). Un subset de gene care au o cerinţă directă pentru TAF _II 145 funcţie şi care sunt implicate în funcţiile asociate cu progresia prin intermediul ciclului celular sunt enumerate în tabelul 2. De exemplu, o scădere semnificativă a nivelului mRNA a fost observată pentru CTR9, care sunt necesare pentru exprimarea de cyclins G1 CLN1 şi CLN2. În plus, genele care sunt implicate în repararea ADN-ului şi sinteza ADN-ului sunt dependente de TAF _II 145 funcţie. Astfel, arestarea G1 / S pheno-tip de TAFII145 mutanti pot fi cauza unor defecte multiple în cyclin şi sinteză cromozom care au loc în această perioadă a ciclului celular.

Am analizat următoarele genele care depind de TAFII17, un H3 histone-ca TAF, care este împărtăşită de TFIID şi complexe SAGA, pentru exprimarea lor. ARN-ul a fost izolată de la un TAF _II 17 celule sensibile la temperatură (TAF17-TS) şi a sălbatic de tip omologul 45 min după o schimbare de temperatura nonper-misiva şi a fost hibridizat la HDAs. De

Tabelul 2. Genele că Require Taf145 Funcţia

Ciclului celular

Gene * exponate dependenţa echivalente privind Taf145 şi Rpb1 de exprimare normală.

drojdie gene identificate în TAF _II 17 experiment şi adecvate pentru comparaţie, 67% sunt la fel de dependente de TAF _{al II-lea} 17 funcţionat ca acestea sunt pe Rpb1 şi sunt, astfel, cel mai probabil de a avea o cerinţă directă pentru TAFII17 funcţiei (a se vedea Genome-Wide de date Expression pe site-ul web pentru detalii). Acest lucru indică faptul că TAF _II 17 este critică pentru expresia de o parte mult mai mare decât a transcriptomului TAFII145. Prezenţa TAFII17 în două complexe diferite pot considerare pentru această observaţie.

Dependenţa de Gcn5 subunităţi de SAGA

Descoperirea recentă că anumite componente ale TAFs sunt atât factor de transcriere TFIID generale şi complexe SAGA (Grant et al., 1998) face deosebit de interesant pentru a compara efectele de o mutatie a unei specifice pentru fiecare complex (TAFII145 în caz de TFIID, şi Gcn5, în cazul de SAGA) cu cele de o mutatie într-o componentă comun de către cele două complexe (TAF componenta _II 17). Profilul de expresie a unui GCN5 text eliminat mutant a fost comparat cu omologul său izogenice (a se vedea Genome-Wide Date Exprimarea pe site-ul web pentru detalii). Din 4912 gene care au fost marcate, 185 transcrieri au fost reduse de 2 ori sau mai mult şi articolul 83 a crescut de 2 ori sau mai mult.

Gcn5 Rezultatele indică faptul că această componentă a SAGA este necesar pentru exprimarea normală a nu mai mult de 5% din gene drojdie. Exprimarea de 16% de proteine ​​de codificare gene depinde de TAF _II 145 subunitate TFIID în aceeaşi măsură în care depind de Rpb1. În schimb, expresia de 67% din gene depinde de drojdie în funcţie de TAF _{al II-lea} 17 subunităţi şi împărtăşite de SAGA TFIID.

Cerinţe distincte de componente de maşini transcriptie

Analiza efectuată până în prezent indică faptul că subunitatea Rpb1 de bază polimerazei ARN al II-lea, subunitate Srb4 a complexului SRB / mediator, şi subunitate Kin28 a TFIIH general, factor de transcriere, în general, sunt necesare pentru transcriere de proteine-codare gene. În schimb, expresia de numai un subset de gene este dependentă de Med5, Srb5, Srb10, Swi2, TAF _N 145, TAF _N 17, şi Gcn5. Seturi de gene a caror expresie necesită diferite ARN-polimerazei II componente holoenzyme sunt comparate în diagrama Venn în figura 3A. În mod similar, set de gene a caror expresie necesită diferite TFIID şi componente SAGA sunt prezentate într-o diagramă Venn în Figura 3B. Aceste diagrame arată cum seturi distincte de gene necesită funcţia de componente distincte de maşini de transcriere. Aceste date sugerează că regulament coordonează de seturi mari de gene ar putea fi realizat prin afectarea funcţiei de componente specifice ale echipamentului transcriptie. Dacă acesta este cazul, atunci ar fi de aşteptat ca relaţiile funcţionale existente între unele gene în cadrul acestor seturi, astfel cum a fost observată cu TAFII145.

Srb5 are roluri neaşteptate în răspuns Feromoni

A fost surprinzător faptul că multe dintre genele ale căror niveluri de mARN sunt cel mai dramatic afectate de pierderea de Srb5 se încadrează în calea răspunsului feromoni. 15 gene implicate in raspunsul feromoni care sunt exprimate la niveluri considerabil mai mici în absenţa unor Srb5 sunt prezentate în Figura 4A. Efecte dramatice sunt observate la genele implicate in producerea factorului de împerechere şi de export; expresia MFA1 şi MFA2, cele doua gene codare feromoni de imperechere un factor-, au scazut cu 28-ori şi 11fold, respectiv. Genele suplimentare implicate in maturarea (STE13) şi de export (STE6) a factorului de împerechere sunt exprimate la niveluri considerabil mai mici decât în tipul sălbatic înrudit. În plus, mai multe componente de cale transductie de semnal care răspunde de împerechere pher-omone sunt exprimate la niveluri reduse în mutant Srb5. Aceste gene includ receptorilor pentru feromoni (STE2), subunităţi de proteine ​​de semnalizare G (GPA1), şi factor de transcriere care este ea însăşi ţinta de răspuns de semnalizare şi reglementează în mod direct expresia genelor ulterioare (STE12).

Genomului la nivel de profil de expresie pentru mutantă Srb5 sugereaza ca aceste celule ar trebui să prezinte un defect în eficienţă de împerechere, un fenotip nu am avut anterior suspectate sau investigate. Într-adevăr, testele cantitative împerechere arată că mutante Srb5 are un defect semnificativ în împerechere (figura 4B). Defect de imperechere a fost mai pronunţată decât că, din cauza mutatii in Fus3, o kinaza MAP necesare în vederea arestării ciclului celular şi fuziunea celulară în cursul împerecherii, dar mai puţin pronunţată decât că, din cauza mutatii in STE12. defect în deficit de imperechere pot reflecta SRB5 dependente de coordonate regulament al set de gene răspuns feromoni identifică prin analiza genomului la nivel de expresie.

A. RNAP II Holoenzyme Components

B. TFIID şi Components SAGA

Figura 3. Genome-Wide Dependenţa de componente cheie ale Machinery Transcriere

(A) ARN-polimerazei II componente holoenzyme arată modele distincte de control al genomului. Diagrama Venn care descriu Srb5-,-Swi2, Srb10-şi Med6 dependente de gene (cercuri mici) în ceea ce transcriptomului întreg (Rpb1-, Srb4-şi Kin28-dependente; cerc mare). Numerele de sub fiecare nume de subunitate sunt ofgenes suma a cărei expresie depinde de aceasta subunitate.

(B) Genome modele de control pentru componente de TFIID şi SAGA.

Coordonează Regulamentul de gene cu Nutrienţi răspuns prin infometare, prin intermediul Srb10

Analiza a arătat că Srb10 este un reglator negativ de 173 de gene. Este de remarcat faptul că aproape jumătate din aceste gene sunt derepressed în timpul privarea de nutrienţi care apare în timpul schimbare diauxic (DeRisi et al., 1997) (Figura 5). Celulele de drojdie sunt supuse o schimbare diauxic ca nutrienţi sunt epuizate în cultură, şi o varietate de gene care permit celulă pentru a supravieţui în nutrienţi limitator de condiţii sunt dere-presate (Yin Etal, 1996.). Acestea includ gene implicate in morfologia dimorfici (nutrienţi-au murit de foame celule modifica morfologia lor pentru a permite căutând nutrienţi) şi răspunsurile stres (celulele au murit de foame sunt aparent mai capabili de a supravieţui privarea de nutrienţi atunci când proteinele de stres sunt crescute). Srb10 în celulele de tip sălbatic este cel mai probabil, responsabil pentru reprimarea acest set de gene atunci cand celulele sunt în creştere exponenţială în glucoză, dar nu mai îndeplineşte această funcţie ca celulele introduceţi schimbare diauxic. Regulament de coordonate de acest set de gene ar putea fi realizat prin eliminarea funcţiei de Srb10 ca celule introduceţi schimbare diauxic.

Figura 4. Srb5 este necesar pentru expresia genelor răspuns Feromoni

(A) Feromoni gene de răspuns ale căror niveluri de expresie sunt reduse în absenţa Srb5.

(B) Celulele sunt lipsite de defecte în Srb5 de împerechere. Eficienţei imperechere pentru tulpini mutante sunt exprimate ca procent din eficienţei împerechere a unui izogenice tulpina de tip sălbatic. Pentru comparaţie, tulpinile cu mutaţii în două componente ale caii de împerechere transducţia de semnal (Fus3 şi ste2) sunt incluse.

Pentru a determina dacă este fizic Srb10 pierdut din celule ca acestea intră trecerea diauxic, celulele care conţin un epitop-tag Srb10 proteine ​​au fost cultivate în mass-media şi YPD incluşi în eşantion în diverse momente în timpul curba de creştere (Figura 5C). Lizate de celule au fost pregătite de la fiecare probă, precum şi nivelurile de Srb10 au fost analizate de către Western blot. Datele din figura 5C arată că Srb10 este fizic sărăcit ca celulele intra in faza de crestere diauxic. Acest rezultat este în concordanţă cu dovezi că nivelurile de Srb11, partener cyclin de Srb10, sunt reduse atunci cand celulele sunt expuse la mediul de nutrienţi în sporulaţiei limitator de mass-media (Cooper et al., 1997). Aceasta poate explica de ce, de asemenea, o formă de drojdie holoenzyme purificat din celule de drojdie disponibile pe piaţă nu are Srb10 / Srb11 kinazei / cyclin pereche (Li et al, 1995;.. Myers et al, 1998), ca aceste celule sunt cultivate de obicei, la mijlocul trecut-log fază. Rezultatele indică faptul că astfel de răspuns foame de nutrienţi este mediată, în parte, prin pierderea fizică a CDK Srb10 din holoenzyme. Acest mecanism nou oferă un exemplu al modului de reglementare a coordona expresia genelor poate fi realizat prin regulament al componentelor de maşini de iniţiere generale.

FLO11, care codifica o proteina peretelui celular, care este puternic exprimata in celulele pseudohyphal, este exprimat la niveluri mai ridicate atunci când 15fold Srb10 funcţie este pierdut (Figura 5A). Creştere dramatică în expresia de FLO11 gene şi ale căror produse sunt implicate în schimbare dimorfici ne-au condus pentru a stabili dacă lipsa de Srb10 funcţie produce un fenotip pseudohyphal. Ambele copii ale SRB10 genei au fost sterse dintr-o tulpină diploid, care este, în general, utilizat pentru a analiza acest pheno-tip, şi a morfologiei coloniilor a fost examinată la microscop. Rezultatele din figura 5D demonstrează că pierderea de Srb10 face ca celulele sa creasca preferinţă într-o formă pseudohyphal. Acest lucru arată din nou că analiza expresie este utilă pentru estimarea fenotipurile neaşteptate. Mai important, căi specifice de transducţie a semnalelor de control schimbare dimorfici (Madhani şi Fink, 1998), iar aceste rezultate sugerează că unul dintre obiectivele final al acestor cai este kinazei Srb10.

Discuţie

Am caracterizat mARN populaţia de celule de drojdie şi cerinţa pentru componentele-cheie ale maşinilor transcriptie in expresie a acestei populaţii folosind tehnologia HDA. Descoperiri obţinute din această analiză se numără următoarele. Genome la nivel de expresie este echivalent depinde Srb4 şi Rpb1, sugerând că Srb4 care conţin ARN polimeraza holoenzyme II este, în general, recrutati pentru promotorii de proteine-codare gene. Semnături distincte expresie sunt obţinute atunci când o mare varietate de componente ale aparatului de transcriere sunt inactivate, dezvăluind un nivel de regulament genomului care poate fi suprapusă pe faptul că din cauza unor factori transcrierea genei-specifice. Coordonată de regulament al genelor legate funcţional pot fi efectuate de către reglementarea o componentă a echipamentului iniţiere, aşa cum este ilustrat de regulament al Srb10 şi kinazei suport toate astea rol în răspunsul la nutrientdeprivation. Obiectivele final de anumite căi de transductie semnal poate fi identificat prin compararea genomului expresie de semnături de la aceste experimente şi cele care modifica mediul celular.

Transcriptomului

Noi am estimat numărul de molecule mRNA prezenţi la toate genele într-o singură celulă haploizi, de tip sălbatic folosind datele de HDA (a se vedea mRNA Populaţia Drojdie de pe site-ul web). Aceasta este o reprezentare mai exactă a tran-scriptome decât cea determinată anterior, pentru că este mai în măsură să înscrie specii mRNA care sunt exprimate la niveluri foarte scăzute (5460 gene au fost marcate cu ajutorul HDAs, întrucât 4465 gene au fost marcate cu SAGE). Este deosebit de important să aibă informaţii cu privire la transcrieri de la gene-a exprimat la niveluri scăzute, deoarece multe din componente de reglementare a celulei sunt exprimate la un nivel scăzut.

A.

Figura 5. Srb10 CDK reprimă Genele crescute în timpul de raspuns la foame Nutrient

(A) Subset de 173 de gene a caror expresie niveluri sunt derepressed în celulele lipsite de Srb10 activitatea kinazei.

(B) diagrama Venn care arată numărul de gene care sunt derepressed în timpul privarea de nutrienţi care apare în timpul schimbare diauxic şi fracţiunea din care sunt aceste derepressed în celulele lipsite de Srb10 activitatea kinazei.

(C) Srb10 proteină este epuizate din celulele în care acestea intră în schimbare diauxic. Graficul prezinta curba de creştere a unei tulpini de drojdie a permis să crească la faza staţionară (33 ore). La punctele de timp specificat, părţi alicote dintr-o cultură au fost masurate pentru densitatea de celule, şi sume egale din celule au fost recoltate pentru analiza Western blot. Blots de Vest împotriva epitop-Srb10p contin tag-ul si o proteina de control, Tub2p (TU-bulin), arată că nivelurile de Srb10 scadea substantial ca celulele introduceţi trecerea diauxic (14 - 18 ore).

(D) Celulele lipsite de Srb10 au o activitate kinazei crescut pseudohy-phal creştere. Tulpini folosite la creşterea economică testul pseudohyphal au fost derivate din L5978 şi sunt congenic la fondul genetic E1278b (Liu et al., 1993).

Gene-specifice regulament prin intermediul Maşini Transcriere General

Modelele manual descriu regulament al expresiei genice eucariote ca recrutarea de maşini de transcriere a genelor generale de gene specifice activatori. Rezultatele noastre demonstreaza ca functia de anumite componente cheie ale maşinilor transcriere generală este necesară pentru expresia de seturi distincte de gene, cum este ilustrat în Figura 3. Este posibil ca aceste componente ale maşinilor de transcriere sunt obiective necesare pentru un set specific de gene specifice activatori, şi pierderea unui astfel de componente produce un efect dramatic, la doar acele gene sub controlul astfel de activatori. În acest caz, datele prezentate aici oferă obiective candidate în cadrul maşini de iniţiere pentru activatori la cele mai multe gene de drojdie.

Rezultatele descrise aici au evidenţiat, de asemenea, faptul că un strat de regulament este disponibil la celula în plus faţă de cea prevăzută de către gena specifice de reglementare: expresie de seturi specifice de gene pot fi reglementate prin afectarea disponibilitatea sau funcţia de o componentă specifică a generală maşini. Deoarece diferitele componente ale echipamentelor tehnice generale pot fi acetilat şi fosforilate (Kita-Jima et al, 1994;.. Imhof et al, 1997), este posibil ca aceste modificări să servească pentru a reglementa aceste componente, şi, astfel, genele care necesită funcţiile lor.

Insights în Rolurile Complexe de transcriptie componente ale aparatului de transcriere care au fost punctul central al acestui studiu au fost selectate, deoarece acestea sunt printre cele subunităţi cheie ale complexelor multiprotein majore care au roluri în transcriere de proteine-codare gene. Aceste complexe includ ARN poli-merase II enzimei de bază, factori de transcriere generală (GTFs), SRB de bază / complex de mediator, Srb10 CDK complex, complex SWI / SNF, iar complexul SAGA. Am constatat că cele trei componente au fost, în general, necesare pentru transcriere de proteine-gene care codeaza (Rpb1, Kin28, Srb4). Două au fost găsite a fi necesare pentru mai mult de jumătate, dar nu toate genele (Tfa1, Taf17). Majoritatea componentelor investigate până acum au fost necesare pentru transcriere de mai puţin de o cincime din genomului (Srb5, Med6, Srb10, Swi2, Taf145, Gcn5). În acest din urmă grup, elementele de probă indică faptul că Srb5, Med6, şi Taf145 au roluri preponderent pozitive, Srb10 are un rol aproape exclusiv negativ, şi Swi2 Gcn5 şi poate avea fie o pozitiv sau un rol negativ în expresia genelor.

Factori generale

Deoarece Rpb1 Srb4 şi proteine, în general, sunt necesare pentru exprimarea de proteine-gene care codeaza, si sunt ambele asociate strâns şi exclusiv cu ARN poli-merase al II-lea şi complexul de mediator, respectiv (Kim et al, 1994;. Koleske şi tânăr, 1994; Myers et al, 1998.), putem deduce faptul că ARN-polimerazei II şi mediatorul complex de bază sunt, în general, necesare pentru transcriere. Presupunând că funcţia de Kin28 este limitată la TFIIH, datele obţinute cu mutante Kin28 demonstrează că TFIIH este un factor general. Deoarece 54% din gene drojdie sunt la fel de dependente de Tfa1 astfel cum acestea sunt pe Rpb1, deducem că TFIIE este direct implicat în expresia a cel puţin 54% de proteine-gene care codeaza, dar fără să ştie contribuţia Tfa2, subunitatea de alte TFIIE, nu putem elimina posibilitatea ca TFIIE are roluri la gene suplimentare.

SRB / Complex Moderator

Complexul de bază SRB / mediator este esenţială pentru transcrierea generale, după cum reiese din cerinţa de Srb4, dar componente cum ar fi Srb5 şi Med6 au roluri la subseturi specifice de gene. Aceste rezultate sunt în concordanţă cu propunerea ca complex SRB / mediator este recrutat de promotori din majoritatea genelor, împreună cu ARN-polimerazei II, în cazul în care aceasta acţionează într-un mod analog cu un procesor de semnal cu capacitatea de a integra efectele combinatoriale de intrari multiple de la gene specifice activatori transcriptie şi repressors (Kim et al, 1994;. Koleske şi tânăr, 1994; Koh et al, 1998;. Myers et al, 1998;.. Sun et al, 1998).

Srb10 CDK Complex

Funcţia complexului Srb10 CDK poate fi definit de către kinazei în sine, deoarece pierderea-de-funcţia de mutatii in oricare dintre cele patru componente ale acestui complex produc fenotipuri identice (Hengartner et al, 1995;. Carlson, 1997). Kinaza Srb10 este un reglator negativ al o parte considerabila de gene care sunt reprimate atunci cand celulele cresc vegetative în mass-media bogate şi sunt induse ca celulele experienţă privarea de nutrienţi. Genele reglementate de Srb10 sunt implicate in raspunsul la stres nutrienţi şi în schimbările morfologice care permite cautare a hranei pentru nutrienţi. Srb10 este fizic epuizate din celulele în care acestea intră în schimbare diauxic, oferind un mecanism de dere-presiunea de acest set de gene. Srb10 în sălbatic de tip celule este astfel responsabil pentru reprimarea acest set de gene atunci cand celulele sunt în creştere exponenţială în glucoză, dar nu mai îndeplineşte această funcţie ca celulele introduceţi schimbare diauxic.

SWI / SNF Complex

În cazul în care funcţia de complex SWI / SNF este ATP-dependente remodelare a cromatinei (Laurent et al, 1993;.. Cote et al, 1994), atunci efectele pe care le observa, datorită mutaţiei ATPase Swi2 ar trebui să reprezinte dependenţa de genomului- expresie larg cu privire la întregul SWI / SNF complexe. Rezultatele indică faptul că un număr mai mare de gene sunt reglementate de negativ SWI / SNF decat cele care sunt reglementate în mod pozitiv. Acest lucru este surprinzător, având în vedere a modelului pe care SWI / SNF-catalizată de remodelare a cromatinei facilitează activator obligatoriu. Este posibil ca remodelarea cromatinei poate facilita factori obligatorii de factori negativi, precum şi pozitiv. O posibilitate alternativă este sugerat de date recente care indică faptul că complexul de SWI / SNF poate remodela cromatinei în ambele direcţii: ea poate converti o structură represivă nucleosome spre o stare mai accesibil, şi vice-versa (Schnitzler et al, 1998.). Prin urmare, este posibil ca SWI / SNF ajuta la producerea unui nucleosome structură care să conducă la transcrierea la unele promotori, şi o structură care este represivă la alţii.

TFIID şi SAGA

General de transcriere factor TFIID şi complex parts SAGA două caracteristici: ambele contin o subunitate capabil de acetilare histone (TAF _II 145, în cazul de TFIID Gcn5 şi, în cazul de SAGA) şi au în comun mai multe subunitati, printre care se histone H3-cum ar fi TAF, TAF _II 17 (Grant Etal, 1998.). Ca rezumate în Figura 4, rezultatele indică faptul că Gcn5, TAF _II 145, şi TAF _II 17 sunt necesare pentru exprimarea de 5%, 16%, şi 67% din gene drojdie, respectiv. Două modele pot considerare pentru aceste date: o postulează că TAFII17 funcţionează exclusiv în cadrul TFIID şi complexele SAGA, şi alte TAF _II 17 este o componentă de una sau mai multe complexe suplimentare. Dacă TAF _II 17 funcţii exclusiv în cadrul TFIID şi SAGA, apoi TAF _{al II-lea} 145 şi Gcn5 nu reprezintă în totalitate funcţiile celor două complexe, deoarece suma de gene care necesită TAFII145 şi Gcn5 funcţie este mult mai mic decât numărul de gene care necesită TAFII17. În acest model, unul sau ambele complexe conţin subunităţi care fac diferitele contribuţii la expresia genelor, cum ar fi de aşteptat dacă subunităţi diferite sunt tinte de activatori diferite transcriptie şi repressors. Rezultatele pot fi, de asemenea, cazat într-un al doilea model, în care TAFII17 este o componentă de una sau mai multe complexe în plus faţă de TFIID şi SAGA. Rezultatele descrise aici pune bazele util pentru experimente suplimentare necesare pentru a obţine o înţelegere mai deplină a rolurilor de TFIID şi subunităţi SAGA în expresia genelor.

Datele noastre, coroborat cu faptul că de studiile anterioare, au evidenţiat mai multe similitudini frapante între TAF _II- 145 şi a factorilor de procariote sigma. În primul rând, ambii factori sigma şi TAFII145 sunt componente ale maşinilor transcriere generală. În al doilea rând, mulţi factori sigma sunt necesare pentru expresia de un subset legate de gene, de asemenea, am aratat ca TAF _II- 145 pare a fi necesare pentru exprimarea unui set de gene implicate in sinteza cromozomiale şi G1 / S progresie. În cele din urmă, ambii factori sigma şi TAFII145 acţionează prin elemente de promotor de bază prin contacte directe ADN-ului.

Dezvoltarea unui control Genome Harta rezultatele descrise aici sprijin posibilitatea de a diseca circuitele de reglementare a genomului de drojdie prin utilizarea genomului analiza întregului exprimare pe celule cu mutaţii în aparatul de transcriere. Set de gene drojdie de bere a căror expresie depinde de funcţiile de componente cheie ale maşinilor transcriptie a fost identificate. Semnaturile genomului la nivel de expresie produsă de leziuni în componentele specifice ale aparatului transcriere sunt destul de diferite, ceea ce face posibil să ne imaginăm o hartă de control al genomului. O astfel de hartă ar identifica toate componentele maşinilor de transcriptie, care au roluri la un anumit promotor şi contribuţia pe care componentele specifice fac să-şi coordoneze regulament de gene. Harta va facilita modelarea mecanismelor moleculare care regleaza expresia genelor şi implică componente ale aparatului de transcriere în interacţiuni funcţionale cu gene specifice de reglementare.

Proceduri experimentale

Informaţii detaliate cu privire la procedurile experimentale, reactivi genetică, tehnologia HDA, şi analiză a datelor pot fi găsite pe World Wide Web la http://www.wi.mit.edu/young/expression.html în secţiunea numită Studiu de design.

Mulţumiri

Suntem recunoscători pentru Gwen Acton, Fink Gerry, Galitski Tim, Hannett Nancy, Hartemink David, Lewitter Fran, Madhani Hiten, Johnny Park, Steve Rozen, Michael Sayre, Struhl Kevin, Pablo Tamayo, Theilhaber Joachim, şi Winzeler Elizabeth pentru discuţii de ajutor, observaţii cu privire la manuscris, sugestii pentru site-ul web, si suport software. Mulţumim David Allis, Gerard Faye, Young-Joon Kim, Craig Peterson, şi Michael Sayre pentru reactivi, şi sunt deosebit de recunoscător pentru Vic Myer pentru furnizarea contin tag-ul Srb10 tulpina. Această lucrare a fost sustinuta de fonduri de la NIH, Bristol-Myers Squibb Company, Inc Affymetrix, si Millennium Pharmaceuticals Inc FCPH a fost susţinută de burse de la EMBO şi umane Programul de ştiinţă de frontieră; EGJ este un om predoctoral de Institutul Medical Howard Hughes, şi JJW este un om predoctoral de Fundatia Nationala pentru Stiinta. TRG este un beneficiar al unui premiu Burroughs Wellcome-Cariera Fondului în stiinte biomedicale.

Primit 14 august 1998;. Revizuit 30 septembrie 1998

Referinţe

Burley, SK, şi Roeder, RG (1996). Biochimie şi Biologie structurale de factor de transcriere IID (TFIID). Annu. Rev Biochem. 65, 769-799.

Burns, LG, şi Peterson, CL (1997). Drojdie SWI-SNF complex facilitează obligatoriu de transcriptie activator la site-uri nucleosomal in vivo. Mol. Celulă. Biol. 17, 4811-4819.

Carlson, M. (1997). Genetica de regulament transcriptie din drojdie: conexiunile la ploymerase ARN II CTD. Annu. Rev Cell Dev. Biol. 13, 1-23.

Chee, M., Yang, R., Hubbell, E., Berno, A., Huang, XC, Stern, D., Winkler, J., Lockhart, DJ, Morris, MS, şi Fodor, SP (1996).

Accesarea de informaţii genetice, cu matrice de ADN de mare densitate. Ştiinţă 274, 610-614.

Cho, RJ, Campbell, MJ, Winzeler, EA, Steinmetz, L., Conway, A., Wodicka, L., Wolfsberg, TG, Gabrielian, AE, locuitor de uscat, D., Lockhart, DJ, şi Davis, RW (1998 ). O genomului la nivel transcrip-ţionale analiză a ciclului celular mitotic. Mol. Cell 2, 65-73. Cooper, KF, Mallory, MJ, Smith, JB, şi Strich, R. (1997). Stresul şi reglementarea de dezvoltare ale drojdie de tip C cyclin Ume3p (Srb11p/Ssn8p). EMBO J. 16, 4665-4675.

Cote, J., Quinn, J., Workman, JL, şi Peterson, CL (1994). Stimularea GAL4 derivate legare de ADN nucleosomal de drojdie SWI / SNF complexe. Ştiinţă 265, 53-60.

Dahmus, M. (1996). De fosforilare reversibilă a domeniului C-terminal al II-lea polimerazei ARN-ului. J. Biol. Chim. 271, 19009-19012.

De Risi, J., Penland, L., Brown, PO, Bittner, ML, Meltzer, PS, Ray, M., Chen, Y., Su, YA, şi Trent, JM (1996). Utilizarea unui microarray ADNc pentru a analiza modele expresia genica in cancerul uman. Nat. Genet. 14, 457-460.

De Risi, JL, Iyer, VR, şi Brown, PO (1997). Explorarea controlului metabolic şi genetice de expresia genelor pe o scară de genomica. Ştiinţă 278, 680-686.

Grant, PA, Schieltz, D., Rugaţi-vă-Grant, MG, Steger, DJ, Reese, JC, Yates, JR, şi Workman, JL (1998). Un subgrup de TAF _n s fac parte integrantă din complexul SAGA necesare pentru acetilare nucleosome şi stimularea transcriptie. Celula 94, 45-53.

Gray, NS, Wodicka, L., Thunnissen, A.-M., Norman, TC, Kwon, S., Espinoza, FH, Morgan, DO, Barnes, G., Leclerc, S., Meijer, L., et Al. (1998). Exploatarea biblioteci chimice, structura, si genomica în căutarea de inhibitori de kinazei. Ştiinţă 281, 533-538.

Greenblatt, J. (1997). ARN polimerazei holoenzyme II şi transcrip-ţionale regulament. Pac. Aviz din. Cell Biol. 9, 310-319.

Hampsey, M. (1998). Genetica moleculară a ARN-polimerazei II generale maşini de transcriptie. Microbiol. Mol. Biol. Apoc. 62, 465-503.

Hengartner, CJ, Thompson, CM, Zhang, J., Chao, DM, Liao, SM, Koleske, AM, Okamura, S., şi tânăr, RA (1995). Asociaţia de un activator cu un ARN polimerazei holoenzyme al II-lea. Genele Dev. 9, 897-910.

Hengartner, CJ, Myer, VE, Liao, S.-M., Wilson, CJ, Koh, SS, şi tânăr, RA (1998). Regulament temporală a polimerazei ARN al II-lea de către Srb10 şi Kin 28 de ciclin-dependent kinaze. Mol. Celula 2, 43-53.

Herrick, D., Parker, R., şi Jakobson, A. (1990). Identificarea şi compararea mRNAs ofstable şi instabilă în Saccharomyces CeRe-visiae. Mol. Celulă. Biol. 10, 2269-2284.

Holstege, FC, Tantin, D., Carey, M., van der Vliet, PC, şi-Tim Mers, HT (1995). Cerinţa pentru IIE bazală factor de transcriptie este determinat de stabilitatea elicoidale a ADN-ului promotor. EMBO J. 14, 810-819.

Imbalzano, AN, Kwon, H., verde, MR, şi Kingston, RE (1994). Facilitat obligatoriu de TATA de proteina de legare la ADN-ul nucleosomal. Natura 370, 481-485.

Imhof, A., Yang, XJ, Ogrîzko, VV, Nakatani, Y., Wolffe, AP, şi Ge, H. (1997). Acetilare de factori de transcriptie general de acetyltransferases histone. Pac. Biol. 7, 689-692.

Khavari, PA, Peterson, CL, Tamkun, JW, Mendel, DB, şi Crabtree, GR (1993). BRG1 conţine un domeniu conservat de familie SWI2/SNF2 necesare pentru creşterea normală şi mitotice transcriere. Natura 366, 170-174.

Kim, Y.-J., BJÖRKLUND, S., Li, Y., Sayre, MH, şi Kornberg, RD (1994). Un mediator multiprotein de activare transcriptie şi interacţiunea acestuia cu domeniul repeta C-terminal al ARN-polimerazei Al II-lea. Celula 77, 599-608.

Kingston, RE, Bunker, CA, şi Imbalzano, AN (1996). Represiunea şi de activare de complexe multiprotein care modifică structura cromatinei. Genele Dev. 10, 905-920.

Kitajima, S., Chibazakura, T., Yonaha, M., şi Yasukochi, Y. (1994). Regulament al TFIIF uman general, factor de transcriere iniţierea de către fosforilare. J. Biol. Chim. 269, 29970-29977.

Koh, SS, Ansari, AZ, Ptashne, M., şi tânăr, RA (1998). O ţintă activator în ARN polimerazei holoenzyme II. Mol. Celula 1, 895-904.

Koleske, AJ, şi tânăr, RA (1994). Un ARN-polimerazei holoenzyme II receptiv la activatori. Natura 368, 466-469.

Kuchin, S., şi Carlson, M. (1998). Relaţii funcţionale de Srb10-Srb11 kinazei, kinaza domeniu carboxi-terminal CTDK-I, şi tran-scriptional corepressor Ssn6-Tup1. Mol. Celulă. Biol. 18, 1163-1171.

Kuldell, NH, şi Buratowski, S. (1997). Analiza genetică a subunitate mare de IIE factor de drojdie de transcriere relevă cele două regiuni cu funcţii distincte. Mol. Celulă. Biol. 17, 5288-5298.

Kwon, H., Imbalzano, AN, Khavari, PA, Kingston, RE, şi verde, MR (1994). Întreruperi Nucleosome şi consolidarea de activator obligatoriu printr-o complex SW1/SNF uman. Natura 370, 477-481.

Lashkari, DA, De Risi, JL, McCusker, JH, Namath, AF, Gentile, C., Hwang, SY, Brown, PO, şi Davis, RW (1997). Drojdie microar-raze pentru analiza genomului la nivel paralel expresie genetică şi gena. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 94, 13057-13062.

Laurent, BC, Treich, I., şi Carlson, M. (1993). Drojdie SNF2 / Proteină SWI2 a ADN-ului, stimulat activitatea ATPase necesare Fortran- scriptional de activare. Genele Dev. 7, 583-591.

Lee, TI, şi tânăr, RA (1998). Regulamentul de expresia genelor de către TBP-asociate proteine. Genele Dev. 12, 1398-1408.

Lee, YC, Min, S., Gim, BS, şi Kim, YJ (1997). O transcriptie proteine ​​mediator care este necesar pentru activarea mai multor ARN polimerase promotori II şi se conservă de la drojdie la om. Mol. Celulă. Biol. 17, 4622-4632.

Lee, TI, Wyrick, JJ, Koh, SS, Jennings, EG, Gadbois, EL, şi tânăr, RA (1998). Interacţiune a autorităţilor de reglementare pozitive şi negative în iniţierea transcriere de către ARN-polimerazei II holoenzyme. Mol. Celulă. Biol. 18, 4455-4462.

Li, Y., BJÖRKLUND, S., Jiang, YW, Kim, YJ, Lane, A FOST, Stillman, DJ, şi Kornberg, RD (1995). Drojdie de reglementare la nivel mondial transcriptie Sin4 şi Rgr1 sunt componente ale complexului mediator / poli-merase ARN holoenzyme al II-lea. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 92,10864-10868.

Liao, SM, Zhang, J., Jeffery, DA, Koleske, AJ, Thompson, CM, Chao, DM, Viljoen, M., van Vuuren, HJ, şi tânăr, RA (1995). O pereche kinazei-cyclin în ARN polimerazei holoenzyme al II-lea. Natura 374, 193-196.

Liu, H., Stiluri, CA, şi Fink, GR (1993) Elemente din calea răspunsului drojdie feromoni necesari pentru o crestere de filamentoase diploids. Ştiinţă 262, 1741-1744.

Lockhart, DJ, Dong, H., Byrne, MC, Follettie, MT, Gallo, MV, Chee, MS, Mittmann, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H., şi Brown, EL ( 1996). Monitorizarea expresie de hibridizare la matrice oligonucleotidului de înaltă densitate. Nat. Biotechnol. 14, 1675-1680.

Madhani, HD, şi Fink, GR (1998) de control de diferenţiere filamentoase şi virulenta in ciuperci. Tendinţe Cell Biol. 8, 348-353.

Myer, V., şi tânăr, RA (1998). ARN polimerazei holoenzymes al II-lea şi subcomplexes. J. Biol. Chim. 273, 27757-27760.

Myers, LC, Gustafsson, CM, Bushnell, DA, Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., şi Kornberg, RD (1998). Proteinele Med de drojdie şi a funcţionării lor prin intermediul ARN polimeraza II carboxi-terminale domeniu. Genele Dev. 12, 45-54.

Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., şi tânăr, RA (1987) eucariote ARN polimeraza condiţionată mutante care încetează rapid sinteza ARNm. Mol. Celulă. Biol. 7, 1602-1611.

Orphanides, G., Lagrange, T., şi Reinberg, D. (1996). Factori generali de transcriere a ARN-polimerazei II. Genele Dev. 10, 26572683.

Parvin, JD, Timmers, HT, şi Sharp, PA (1992). Specificitatea promotor al factori de transcriptie bazale. Celula 68, 1135-1144. Ptashne, M., şi Gann, A. (1997). Activare transcriptie de recrutare. Natura 386, 569-577.

Roeder, RG (1996). Rolul factorilor de iniţiere în general, transcriere de către polimeraza ARN-al II-lea. Tendinţe Biochem. Sci. 21, 327-335. Roth, SY, şi Allis, CD (1996). Acetilare histone şi asamblarea cromatinei: un singur escorta, dansuri multiple? Celula 87, 5-8. Sakurai, H., Ohishi, T., şi Fukasawa, T. (1997). Structura-dependente de promotor de funcţionare a IIE general, factor de transcriere în Sac-charomyces cerevisiae. J. Biol. Chim. 272, 15936-15942.

Schena, M., Shalon, D., Heller, R., Chai, A., Brown, PO, şi Davis, RW (1996). Analiza genomului uman paralel: microarray de monitorizare bazate pe expresia de 1000 de gene. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 93, 10614-10619.

Schnitzler, G., Sif, S., şi Kingston, RE (1998). Omului SWI / SNF interconverts o nucleosome între stat bazei sale şi un stat stabil remodelate. Celula 94, 17-27.

Serizawa, H., Conaway, JW, şi Conaway, RC (1993). Phosphory-lament de C-terminale domeniul polimerazei ARN al II-lea nu este necesară în transcrierea bazale. Natura 363, 371-374.

Steger, DJ, andWorkman, JL (1996). Remodelingchromatinstruc-mice pentru transcriere: ce se întâmplă cu histones? Bioessays 18, 875-884.

Struhl, K. (1995). Drojdie transcriptional de mecanisme de reglementare. Annu. Rev Genet. 29, 651-674.

Struhl, K. (1998). Acetilare histone şi mecanisme de transcriptie de reglementare. Genele Dev. 12, 599-606.

Duminica, X., Zhang, Y., Cho, H., Rickert, P., Lees, E., Lane, W., şi Reinberg, D. (1998). NAT, un complex uman care conţin SRB polypep-mareelor, care funcţionează ca un regulator negativ de transcriere activat. Mol. Celula 2, 1-11.

Thompson, CM, şi tânăr, RA (1995). Cerinţă generală pentru ARN-polimerazei holoenzymes al II-lea in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 92, 4587-4590.

Thompson, CM, Koleske, AJ, Chao, DM, şi tânăr, RA (1993). Un complex multisubunit asociate cu ARN polimeraza II CTD şi Tata-legarea de proteine ​​din drojdie. Celula 73, 1361-1375. Tijerina, P., şi Sayre, MH (1998). O mutaţie debilitante în IIE factor de transcriere, cu efecte asupra diferenţial expresia genelor în drojdie. J. Biol. Chim. 273, 1107-1113.

Timmers, HT (1994). Transcrierea iniţierea de către polimeraza ARN-al II-lea nu are nevoie de hidroliza phosphoanhydride beta-gamma obligaţiuni de ATP. EMBO J. 13, 391-399.

Tsukiyama, T., şi Wu, C. (1997). Cromatinei remodelare şi transcriere. Pac. Aviz din. Genet. Dev. 7, 182-191.

Velculescu, VE, Zhang, L., Zhou, W., Vogelstein, J., Basrai, MA, Bassett, DE, Jr., Hieter, P., Vogelstein, B., şi Kinzler, KW (1997). Caracterizarea transcriptomului drojdie. Celula 88, 243-251.

Verrijzer, CP, şi Tjian, R. (1996). TAFs medieze activare transcriptie şi selectivitate promotor. Tendinţe Biochem. Sci. 21, 338-342.

Walker, SS, Shen, W.-C., Reese, JC, Apone, LM, şi verde,

MR (1997). Drojdie TAF _n 145 necesare pentru transcriere a genelor cyclin G1 / S şi reglementată de către stat creşterii celulare. Celula 90, 607-614.

Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, MH, şi Lockhart, DJ (1997). Genome la nivel de monitorizare exprimare în cerevisiae cer-evisiae. Nat. Biotechnol. 15, 1359-1367.

Yin, Z., Smith, RJ, şi Brown, AJ (1996). Multe cai de semnalizare declanşa sensibilitatea deosebita a mRNAs drojdie gluconeogenic la glucoză. Mol. Microbiol. 20, 751-764.