Back to site
Since 2004, our University project has become the Internet's most widespread web hosting directory. Here we like to talk a lot about web development, networking and server security. It is, after all, our expertise. To make things better we've launched this science section with the free access to educational resources and important scientific material translated to different languages.

Tehnologie de recombinare a ADN-ului în sinteza de insulină umană

Source: http://www.littletree.com.au/dna.htm

Author: Ilanit Tof. Translator:Alexander Ovsov. Translated with permission. Copyright © 1994 Ilanit Tof, All Rights Reserved





Natura şi scopul de sinteză insulină umană.

Din moment ce Banting si Best descoperit hormon, insulina în 1921. (1) la pacienţii cu diabet zaharat, a căror niveluri crescute de zahăr (vezi fig. 1) sunt datorate de producţie insulina, au fost trataţi cu insulină derivate din glandele pancreasul animalelor de abator. Hormon, produs si secretat de catre celulele beta din insulele pancreatice "de Langerhans, (2) reglementează utilizarea şi depozitarea produselor alimentare, în special glucide.

Fig. 1
Fluctuaţiile în nivelurile de persoane cu diabet zaharat de glucoza din sange, comparativ cu persoanele sănătoase. Sursa: Hillson, R. - Diabet: Un dincolo de elementele de bază de folosire, pg.16.

 

Deşi insulină bovină şi porcină sunt similare cu insulină umană, compoziţia lor este uşor diferit. În consecinţă, un număr de sisteme de pacienţi "imunitar produce anticorpi impotriva ei, neutralizarea acţiunilor sale şi care rezultă în răspunsurile inflamatorii la locurile de injectare. Adaugata la aceste efecte adverse ale insulinei bovină şi porcină, au fost temeri de complicatii pe termen lung care decurg din injectarea regulată a unei substanţe străine (3)   precum şi o scădere preconizată în producţia de insulină animală derivate. (4) Aceşti factori au condus cercetătorilor să ia în considerare sintetizarea Humulin prin introducerea genei insulină într-un vector adecvat, celula bacteriana E. coli, pentru a produce o insulină, care este chimic identic cu omologul său produs în mod natural. Acest lucru a fost realizat folosind tehnologia ADN-ului recombinant. Aceasta metoda (vezi fig. 2) este o mai fiabile şi durabile (5) metoda de extragere si purificare abator de produs.

Fig. 2
O prezentare generală a procesului de recombinare. Sursa: Novo - Nordisk broşură promoţională, pag. 6. 

 

Înţelegerea genetica implicate.

Structura de insulină.

Chimic, insulina este o proteina mic, simplu. Se compune din 51 de aminoacizi, din care 30 reprezintă un lanţ polipeptidic, şi 21 din care cuprinde un lant al doilea. Cele două lanţuri (vezi fig. 3) sunt legate printr-o legătură disulfit. (6)  

Fig. 3
Sursa: Chance, R. şi Frank B. - Cercetare, dezvoltare, producţie şi siguranţa de insulină biosintetice Omului.

 

În interiorul Double Helix.

Codul genetic pentru insulină se găseşte în ADN-ul din partea de sus a bratului scurt al cromozomului unsprezecea. Acesta conţine 153 baze azotate (63 în lanţ A şi 90 în lanţul B). ADN-ul acid Deoxyribolnucleic), care constituie cromozomul, constă din două helices lungi împletite, construit dintr-un lanţ de nucleotide, fiecare compus dintr-un dezoxiriboză zahăr, o bază de azot şi de fosfat. Există patru baze diferite de azot, adenina, timina, citozina si guanina. (7) sinteza unei proteine ​​specifice, cum ar fi insulina este determinată de ordinea în care aceste baze sunt repetate (vezi fig. 4).

Fig. 4
Strand ADN-ul cu secvenţa de nucleotide specifice pentru lanţul de insulină B. Sursa: Bazat pe diagrama din Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 22.

 

Sinteza insulinei din codul genetic.

Fir dublu a cromozomului al unsprezecelea al ADN-ului imparte in doua, expunerea baze azotate nepereche, care sunt specifice pentru producţia de insulină (vezi fig. 5). 

 

Fig. 5
Unravelling componenta a ADN-ului a cromozomului 11, cu nucleotide expuse de codificare pentru lanţul B de insulină. Sursa: Bazat pe diagrama din Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 22.

 

Folosind unul din ADN-ului expus (a se vedea Fig.6) ca un şablon, ARN mesager face în procesul de transcriere (vezi fig. 7).

   

Fig 6
Un singur fir de ADN care codează pentru lanţul de insulină B. Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare, pag. 13.

 

Fig. 7
(m) ARN strand. Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare, pag. 13.

 

Rolul componenta mRNA, pe care baza de azot timină se înlocuieşte cu uracil, este de a transporta informaţia genetică, cum ar fi faptul că referitoare la insulină, de la nucleul în citoplasma, în cazul în care se ataşează la un ribozom (vezi fig. 8).

Fig. 8
Procesul de conversie la ribozomului. Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare, pag. 13.

Baze azotate pe mARN sunt grupate în trei, cunoscut sub numele de codoni. Transfer ARN (tARN) molecule, trei baze nepereche azot legat-o de aminoacizi specific, colectiv cunoscut ca un codon anti-(a se vedea fig.9), pereche cu complementare baze (codoni), pe mARN. 

Fig. 9
Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare, pag. 13.

 

Lectură a mRNA de tARN de la ribozomului este cunoscut sub numele de traducere. Un lanţ specific de aminoacizi este format din următoarele tARN codul determinată de mARN. Secvenţă de bază a mRNA a fost tradusă într-o secvenţă de aminoacizi care legătură într-împreună pentru a forma proteine ​​specifice, cum ar fi insulina.

 

Vector (coli E. Gram negative).

O tulpină slăbită a bacteriei comune, coli Escherrichia (E. coli) (vezi fig. 10), un locuitor al tractului digestiv uman, este "fabrică" folosite în ingineria genetică de insulină.

Fig. 10
insulină este introdus într-o celulă de E. coli, cum ar fi acest lucru. Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare, pag. 16.

 

În cazul în care bacterie reproduce, gena insulinei este replicat de-a lungul cu plasmida, (8) o secţiune circulară a ADN-ului (vezi fig. 11). E. coli produce enzime care degradeaza rapid, proteine ​​straine, cum ar fi insulina. Prin folosirea unei tulpini mutante, că lipsa acestor enzime, problema este evitată. (9)

Fig. 11
microscop electronic pentru Vector plasmida. Sursa: Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 73.

 

În E. coli, B-galactozidazei este enzima care controlează transcriere a genelor. Pentru a face bacterii produc insulină, gena insulină trebuie să fie legat de această enzimă.

 

În interiorul caseta de instrumente de inginer genetic. 

Enzime restricţie, natural produs de bacterii, cum ar fi actul de scalpele biologice (10)  (a se vedea Fig.12), recunoscând doar se intinde special de nucleotide, cum ar fi cea care codurile pentru insulină. (11)

Fig 12
O analiză similară la enzime Restricţie. Sursa: Cercetare CSIRO din Australia No. 8.

 

Acest lucru face posibilă pentru a rupe anumite perechi de bază de azot şi eliminarea secţiunea a ADN-ului insulină de codificare de la cromozomul un organism, astfel încât se poate produce insulină (a se vedea fig. 13). ADN-ul ligase este o enzimă care serveşte ca un lipici genetică, de sudura capete lipicioase de nucleotide expuse împreună.

Fig. 13
Sursa: Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pag. 78..

Humulin de fabricaţie.

Primul pas este acela de a sintetiza chimic lanţurile ADN-ului care transporta secvente specifice de nucleotide care caracterizează lanţurile A şi B polipeptidul de insulină (vezi fig. 14).

Fig. 14
insulină umană structură. ARN-ul de conversie de aminoacizi pentru a ADN-ului. Sursa: Activităţi de inginerie genetica, pg. 176.

 

Secvenţa de ADN-ul solicitat poate fi determinat deoarece compoziţii de aminoacizi din ambele lanţuri au fost clasat. Şaizeci şi trei de nucleotide sunt necesare pentru sintetiza un lant nouăzeci şi pentru lanţul B, plus o codon, la sfârşitul fiecărui lanţ, de semnalizare încetarea sintezei proteice. Un anti-codon, care încorporează aminoacizi, metionina, este apoi plasat la începutul fiecărui lanţ, care permite eliminarea de proteine ​​insulină din acizi celula bacteriana de aminoacizi. O sintetic şi "gene" B lanţ (vezi fig. 15) sunt apoi introduse separat în gena pentru o enzima bacteriene, B-galactozidazei, care se desfăşoară în vectorul de plasmidă. În acest stadiu, este esenţial să se asigure că codonii a genei sintetice sunt compatibile cu cele ale B-galactozidazei.

 

Fig. 15
Sursa: Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 456..

 

Plasmide recombinante sunt apoi introduse în celule E. coli. Utilizarea practică de tehnologie de recombinare a ADN-ului în sinteza de insulină umană necesită milioane de exemplare de bacterii ale căror plasmida a fost combinat cu gena de insulină, în scopul de a produce insulină. Gena insulinei este exprimat ca o replica cu B-galactozidazei în mitoza celulelor în curs (vezi fig. 16).

 

Fig. 16
Procesul de mitozei. Sursa: Novo Nordisk-brosura de promovare,  pag. 11.

 

Proteină care este format, în parte constă din B-galactozidazei, sa alăturat fie la lanţul de A sau B de insulină (vezi Fig.17). A şi B lanţuri sunt apoi extrase din fragmentul B-galactozidazei şi purificat.

 

Fig. 17
Sursa: Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 456.

 

Cele două lanţuri sunt amestecate şi reconectat într-o reacţie care face cruce bisulfura de poduri, care rezultă în pură Humulin - insulină umană sintetice (vezi fig 18.).

Fig. 18
insulină umană moleculă. Sursa: Sursa: Watson, JD, Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, pg. 456.

 

Implicaţiile biologice de inginerie genetica recombinant insulină umană.

Insulină umană este proteinelor de origine animală doar pentru a au fost făcute în bacterii în aşa fel încât structura sa este absolut identică cu cea a moleculei naturale. Acest lucru reduce posibilitatea de complicaţii rezultate din producerea de anticorpi. În chimice şi studii farmacologice, insulină disponibile în comerţ ADN-ul uman recombinant sa dovedit a fi imposibil de distins de la insulină pancreatice umane. (12) Iniţial dificultate majoră a fost întâmpinate de contaminare a produsului final de către celulele gazdă, crescând riscul de contaminare în bulion de fermentare. Acest pericol a fost eradicat prin introducerea de procese de purificare. În cazul în care produsul final este supus insulină la o baterie de teste, inclusiv cele mai bune tehnici de testul de radio-imuno, (13) nu impurităţi poate fi detectat. (14) Întreaga procedură este acum realizată cu ajutorul celulelor de drojdie ca un mediu de crestere, deoarece acestea secreta o moleculă aproape complet insulină umană cu f. structură tridimensională. Acest lucru minimizează nevoia de procedurile de purificare complexe şi costisitoare.

 

Problema de complicaţii hipoglicemice în administrarea de insulină umană.

Întrucât porcină insulină a fost eliminată, iar majoritatea pacienţilor insulino-dependent sunt acum tratate cu inginerie genetica recombinant de insulină umană, medicii şi pacienţii au devenit îngrijoraţi de creşterea numărului de episoade hipoglicemice cu experienţă. (15) Deşi hipoglicemie pot fi de aşteptat, ocazional, cu orice tip de insulină, unele persoane cu diabet zaharat pretind că sunt mai puţin conştienţi de atacuri de hipoglicemie, deoarece trecerea de la insulina animală provenite de la insulină ADN-ului uman recombinat. (16) Într-un studiu britanic, publicat in The Lancet ", hipoglicemia a fost indusă la pacienţii care utilizează insulină, fie carne de porc sau uman, cercetatorii au descoperit "nici o diferenţă semnificativă în frecvenţa de semne de hipoglicemie între utilizatorii din cele două tipuri diferite de insulină." (17)

Un raport anecdotice de la un pacient britanic care a fost insulino-dependent de treizeci de ani, a declarat că ea a inceput sa se ​​confrunta hipoglicemie recurente, unheralded numai după înlocuirea insulină ADN-ul uman recombinant de insulină de origine animală derivate. După trecerea inapoi la insulină carne de porc pentru a usura mintea ei, ea nu a experimentat nici o hipoglicemie inopinate. Eli Lilly and Co, un producător de insulină umană, a remarcat faptul că o treime din persoanele cu diabet zaharat, care au fost insulino-dependent de peste zece ani, "pierde semnalele de avertizare de hipoglicemie, indiferent de tipul de insulină pe care le adopta." (18)

Dr. Simon P. Wolff a University College din Londra a declarat într-o problemă de Nature, "În măsura în care pot face afară, nu exista nici o vina (cu insulină umană)." El a concluzionat: "Eu nu cred că avem nevoie de un studiu pentru a examina riscul posibil." (19)

Deşi producţia de insulină umană este de necontestat salutată de către majoritatea pacienţilor insulino-dependent, de existenţa unei minorităţi de diabetici, care sunt nemultumiti cu produsul nu poate fi ignorat. Deşi nu este un medicament nou, insulină derivate din această nouă metodă de producţie trebuie să continue să fie studiate şi evaluate, pentru a se asigura că toţi utilizatorii au posibilitatea de a se bucura de o existenţă complicaţie gratuit.

 

Note de final:

1. Banting - publicarii Grolier electronice.

2. Enciclopedia de Ştiinţă şi Tehnologie (McGraw-Hill).

3. ibid.

4. Galloway, JA - Utilizarea Chimie clinică şi de insulină.

5. op. cit.

6. Insulina - Grolier Eloctronic publicarii.

7. Inginerie genetică, Interactive Encyclopedia Compton lui.

8. op. cit.

9. ibid.

10. CSIRO de cercetare din Australia: 8 Biotehnologie, pg. 63.

11. ibid.

12. Galloway, JA - Utilizarea Chimie si clinice de insulină, pg. 106

13. HMge - insulină umană de la ingineria genetică generaţie a doua.

14. ibid.

15. Preţ, J. - Proces peste insulină umană capătă proporţii în Marea Britanie, 26-4-92.

16. ibid.

17. ibid.

18. ibid.

19. ibid.

  

Bibliografie:

Banting - publicarii Grolier electronice.

Charce, RE şi Frank, BH - cercetare, producţie şi siguranţă de insulină umană de biosinteză, 1993.

Curtea, Dr. J. - Condiţii de viaţă modern cu diabet zaharat, diabet zaharat Australia, Melbourne, 1990.

CSIRO de cercetare din Australia Nr.8, Biotehnologie, Canberra, 1986.

Doran, PM - director în biotehnologiei moderne, Hawker Brownlow Educaţiei, 1990.

Enciclopedia de Ştiinţă Tehnologie, McGraw-Hill Company Book, 1987.

Inginerie genetică, Enciclopedia Interactive lui Compton, Compton lui New Media Inc, 1994.

Gillman, M. - Carti Scientific American, WH Freeman and Co din New York, 1992.

Hayward, G. - Genetica Aplicata, Universitatea din Bath, Thomas Nelson şi Sons Ltd, Edinburgh, 1991.

Crisan, Dr. R. - Diabetul, o Dincolo de Noţiuni de bază, Methuen, Melbourne, 1987.

Hmge - insulină umană de la ingineria genetică generaţie de altă parte, Novo.

Insulina, Grolier Electronic Publishing Inc, 1992.

Kammermayor K. şi Clark, VL - Bazele de inginerie genetica, O introducere în Principii si aplicatii, Marcel Decker Inc, 1989.

McCall, C. - Imblanzirea fiarei de Diabet, Washington Times, Washington, 1992.

Morris, B. (ed) - Inginerie genetica, Science în acţiune.

Nacela, GJV şi Coppel, RL - Life Remodelarea: Probleme cheie in ingineria genetica, Melbourne University Press, Melbourne, 1989. Novo Nordisk-promoţionale Brosura.

ADN-ului recombinant, Grolier publicarii Electronic, 1992..

Serjeartson, Prof. S. - Genetica de Diabet, Ioan Curitn Scoala de Cercetari Medicale.

Watson, JD, Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. - ADN-ului recombinant, Cărţi în Scientific American, New York, 1992.

Wibon, J., Tooze, J. şi Hetz, D. - ADN-ului recombinant - un scurt curs, Cărţi în Scientific American Statele Unite ale Americii, 1983.

Published (Last edited): 06-12-2011 , source: http://www.littletree.com.au/dna.htm