Neuroligin1: o adeziune molecula de celule care recrutează PSD-95 şi a receptorilor NMDA prin mecanisme distincte în timpul synaptogenesis

Source: http://www.neuraldevelopment.com/content/4/1/17

Abstract

Fundal

Adeziune celula pereche molecula neuroligin1 (Nlg1) şi β -neurexin (β -NRX) este un inductor puternic de diferenţiere postsynaptic de sinapselor glutamatergic in vitro. Deoarece Nlg1 induce acumularea a două componente esenţiale ale densitate postsynaptic (PSD) - PSD-95 şi receptori NMDA (NMDARs) - şi poate lega fizic PSD-95 şi NMDARs la sinapselor mature, acesta a fost propus ca Nlg1 recrutează NMDARs la sinapse prin sale interacţiunea cu PSD-95. Cu toate acestea, PSD-95 şi NMDARs sunt recrutaţi pentru a sinapselor curs de formare independent şi nu se ştie dacă Nlg1 se acumulează la nivelul sinapselor înainte de aceste proteine PSD. Aici, vom investiga modul în care un singur tip de molecule de adeziune de celule pot recruta mai multe tipuri de proteine sinaptice de noi sinapse cu mecanisme distincte şi cursuri de timp.

Rezultate

Nlg1 a fost prezent în neuroni tineri corticale în două bazine distincte înainte de synaptogenesis, difuze şi grupate. Time-lapse imagistica a arătat că Nlg1 difuze agregate la, şi sa mutat la Nlg1 grupate, site-uri de contact axodendritic cu un curs rapid de timp. Folosind un test patch-uri care grupuri artificial induse de NLG, cursul de timp şi mecanismele de recrutare a PSD-95 şi NMDARs la aceste grupuri au fost caracterizate NLG. Patching NLG grupare indusă de PSD-95 prin intermediul unui palmitoylation dependentă de lent pas. În contrast, NMDARs asociate direct cu clustere de Nlg1 în timpul traficului de persoane. Nlg1 şi NMDARs au fost extrem de colocalized în dendritele înainte de synaptogenesis şi ei au devenit îmbogăţit cu un curs de timp similar la nivelul sinapselor cu inaintarea in varsta. Patching de Nlg1 scazut dramatic mobilitatea de pachete de transport NMDAR. În cele din urmă, a fost Nlg1 biochimic asociat cu NMDAR pachete de transport, probabil prin legarea de NMDARs la MAGUK proteine care, la rândul lor, îşi asumă obligaţii Nlg1. Această interacţiune a fost esenţial pentru colocalization şi de co-de transport de Nlg1 cu NMDARs.

Concluzie

Rezultatele noastre sugereaza ca de contact axodendritic duce la acumularea rapidă a Nlg1, recrutarea de NMDARs co-transportate cu Nlg1 curând după aceea, urmată de o mai lent, de recrutare independent de PSD-95 pentru cei sinapse curs de formare.

Fundal

Formarea sinapselor glutamatergic în sistemul nervos central (SNC) apare rapid după contactul axodendritic prin recrutarea simultană a pachetelor de transport mobile, care conţin proteine de pre-şi postsinaptică [1, 2]. Modelele actuale sugerează că formarea terminalul presinaptic se produce prin recrutarea de vezicule de transport multi-proteine care conţin, în timp ce densitatea postsynaptic (PSD) se formează prin recrutarea independent de proteine postsynaptic[1 - 4].Deşi trans-sinaptice molecule de adeziune induce formarea de sinapse glutamatergic CNS[5, 6], nu este clar atunci când aceste molecule se acumuleaza la primul sinapselor în comparaţie cu alte proteine sinaptice şi modul în care un singur tip de molecule de adeziune de celule (CAM) poate recruta mai multe tipuri de proteine sinaptice de noi sinapse cu mecanisme distincte şi cursuri de timp.

În cursul de formare a PSD, NMDA ((N-metil-D-aspartic acid) receptori (NMDARs) şi proteine schelei PSD-95 sunt recrutaţi pentru a sinapselor curs de formare independent şi cu cursuri diferite de timp [1, 7]. NMDARs sunt prezente în grupuri mobile, numit NMDAR de transport pachete (NRTPs), care sunt rapid recrutati pentru site-uri noi de contact axodendritic, dar nu colocalize cu PSD-95, în dendritele înainte de synaptogenesis[7 - 9]. PSD-95, o molecula de schele proeminent în PSDs mature care se leagă NMDARs[10, 11], este de asemenea prezent în neuroni tineri[7, 8, 12, 13]. Deşi o mică parte din PSD-95 grupuri sunt cele mai mobile, sunt staţionare[12 - 17] şi se acumulează în curs de formare prin intermediul sinapselor coalescent dintr-un bazin difuză[12], cu un curs de timp extrem de variabilă în raport cu recrutarea NMDAR[7, 8, 17].

Formarea PSD glutamatergic este reglementată prin interacţiunile dintre CAM trans-sinaptice β -neurexin (β -NRX) şi neuroligin (NLG)[6, 18 - 22]. Deşi un procent mic de sinapselor glutamatergic se poate forma la un nivel stabil, pre-existente Nlg1 clustere asociate cu complexe molecule schele[13], dinamica Nlg1 înainte de synaptogenesis şi calendarul de Nlg1 de acumulare de la cele mai multe date de contact axodendritic în raport cu alte proteine postsynaptic rămâne necunoscut. Margele sau non-neuronale celule exprima β -NRX induce de grupare a NMDARs şi PSD-95, după 2-4 ore de contact în neuroni CNS prin legarea la NLG pe dendrite postsynaptic[19, 20, 23]. In plus, in exces a Nlgs creşte[19, 20, 24 - 28], si interferenta ARN trântă de Nlgs scade, densitatea sinapselor glutamatergic [24]. În cele din urmă, deşi densitatea sinapsa nu este afectată de lovirea Nlg1, Nlg2 şi Nlg3 (fie individual sau în combinaţie) la soareci, neuroni de la aceste animale a scăzut prezintă NMDAR subunitatea 1 (NR1) expresie şi NMDAR-mediată de transport sinaptice, sugerând că este Nlg1 importante pentru recrutarea de valoarea corectă de proteine postsynaptic a sinapselor[28, 29].

În ciuda dovezilor clare că NLG grupare induce diferenţierea al PSD, nu este clar atunci când se acumulează Nlg1 la sinapselor curs de formare în raport cu primul contact între conuri de crestere axonala şi dendritele şi modul în care s-ar putea recruta Nlgs ulterior NMDARs şi PSD-95 pentru noi sinapse independent şi cu timp distincte cursuri. Pentru a aborda aceste probleme, am folosit un test de patch-NLG, imunocitochimie, time-lapse imagistica, şi biochimice imuno-izolare de NRTPs. Nlg1 este prezent în două bazine distincte pe suprafata de neuroni - difuze şi grupate. De contact Axodendritic duce la acumularea rapidă a Nlg1 din ambele bazine de câteva secunde până la minute de contact. Patching de difuze Nlg1 agregate PSD-95 de la o piscină citoplasmatice printr-un lent palmitoylation-dependente de pas. NMDARs, pe de altă parte, sunt colocalized cu NLG grupate înainte de sinapse sunt formate şi NRTPs mobile au o tendinţă de mare pentru a călători cu NLG. NRTPs pot interacţiona stabil sau tranzitor cu NLG în timpul transportului şi NLG colare reduce dramatic mobilitatea acestora. În plus, ambele biochimice imuno-izolare şi time-lapse imagistica de mutanţi NLG arată că asocierea NLG cu NRTPs se produce prin interacţiuni cu PDZ domeniu care conţin proteine, cum ar fi synapse-asociate proteine (SAP) 102 şi / sau moleculă schele sinaptice (S -SCAM). Rezultatele noastre sugereaza ca formarea veniturilor sinapselor glutamatergic prin recrutarea concomitentă şi rapidă a NMDARs cu Nlg1 la o persoană de contact sinaptice curs de formare urmate de o mai lent, de recrutare independent de PSD-95.

Rezultate

Dinamica de Nlg1 în neuroni corticala

Deşi majoritatea Nlg1 se găseşte pe suprafaţa de neuroni tineri [9, 30], dinamica NLG suprafaţă în timpul synaptogenesis nu a fost descris. Pentru a rezolva această problemă, neuroni corticala la 4-5 zile in vitro (div) au fost transfectate cu proteina fluorescenta verde (GFP)-Nlg1 (care conţine atât o lipitură şi insertii b) şi de suprafaţă expuse GFP a fost etichetat cu anti-GFP fragment Fab (Figura1A). Etichetarea cu acest protocol a arătat o distribuţie difuză de suprafaţă GFP-Nlg1, punctată de către grupări distincte. Peste 99% din clustere de GFP-Nlg1 au fost la suprafata ca doar 0.78% din GFP clustere fluorescente nu au fost relevate de o incubaţie de 10 minute, cu anti-GFP fragment Fab (vârfuri de săgeţi în figura1A). În plus, corelaţia ridicată dintre fluorescenţă GFP şi anti-GFP fluorescenta Fab (R = 0.828, n = 264; Figura1B), precum şi lipsa de permeabilization a acestor neuroni (fişier adiţional1), sugerează că grupurile se află la suprafaţă cu puţin sau deloc bazine interne ale Nlg1. Aceasta localizare este probabil de a reproduce că a Nlg1 endogen, deoarece GFP este situat în domeniul extracelular, făcându-l uşor accesibil pentru anticorpi minimizând în acelaşi timp interferenţele cu molecule intracelulare efectoare, cum ar fi PSD-95 [31]. În plus, GFP-Nlg1 poate lega β -NRX, poate induce formarea de terminale presinaptic pe transfectate non-neuronale celule[32], expresia ei nu afectează în mod negativ sănătatea neuronale, precum şi localizarea acesteia dendritice imita de distribuţie a Nlg1 endogen (fişier adiţional1).

Pentru a examina dinamica Nlg1 înainte şi în timpul synaptogenesis, 4 neuroni div cortical au fost transfectate cu proteine fluorescente cyan (PCP) - sau GFP-tag Nlg1 şi time-lapse imagini 12-14 ore mai târziu. După cum sa raportat în neuroni mai mari hippocampal[13], Nlg1 grupuri s-au realizat în dendritele de neuroni tineri corticale în cultură (Figura 1C). În medie, 11 ± 1,8% din GFP-Nlg1 clustere au fost mobil (de la 6 la 21%), definită ca călătoresc mai mult de 2 μ m, în cursul unei perioade de 10 minute cu imagini care apar în timpul mişcării de cel puţin 3 cadre consecutive (n = 24 neuroni ; interval de 5 s interframe). Clusterele au fost adesea observate în foarte activ filopodia (Figura1C), se deplasează la intrarea şi ieşirea de la sfârşitul filopodium. În orice moment în timpul imagistica, 68.1 ± 11,8% din filopodia aveau cel puţin un grup de GFP-Nlg1 în cadrul acestora şi, în mod interesant, 26,1 ± 10,3% din filopodia au avut un grup de GFP-Nlg1 la vârfurile lor (47 filopodia analizate de la 7 neuroni). Acest lucru trebuie să fie specific de direcţionare a Nlg1 la sfaturi filopodial, deoarece o membrană-ţintă GFP (farnesylated GFP) a fost cea mai mare parte difuze (nu apare pe site). Neuronii exprima GFP farnesylated doar regiunile afişate cu intensitatea fluorescenţei a crescut peste medie (plus o abatere standard) din filopodium întreg în 32.6 ± 5,8% din filopodia şi la sfaturi de 5,1 ± 3,6% din filopodia (46 filopodia analizate de la 6 neuroni; P <0,04).

Deşi carboxi-terminal domeniu PDZ de Nlg1 anterior a fost demonstrat că nu este important pentru NLG concentrarea sau Sediu sinaptice [33], efectele capătul carboxil privind mobilitatea Nlg1 nu au fost raportate. Pentru a caracteriza ceea ce domenii de interacţiune de proteine sunt importante pentru Nlg1 mobilitate, carboxi-terminal GFP-Nlg1 mutante au fost generate care nu aveau nici în ultimii patru aminoacizi (Δ C4), care conţin motivul obligatoriu PDZ, sau ultimele 55 aminoacizi (Δ C55), care conţin domeniu WW şi motivul PDZ obligatoriu (Figura1D). Eliminarea de 55 de aminoacizi de la capătul carboxil al Nlg1 frunze de 17 amino-acizi a motivului 32 aminoacid care joacă un rol în direcţionarea Nlg1 la dendritele[34]. Aceste mutante au fost transfectate text eliminat in neuroni div 4-5 şi 12-14 ore mai târziu sonda. Nlg1 exprimare în neuroni transfectate cu Δ C4 a fost punctiformă, în conformitate cu rapoartele anterioare[33] că motivul PDZ obligatoriu de Nlg1 nu este necesară pentru Sediu de NLG în clustere (Figura1E). În timp ce Δ C55 mutante a fost orientată către dendrite, a fost distribuit difuz, sugerând că carboxi-terminale 55 amino-acizi determina distribuţia punctiformă de Nlg1. Având în vedere că Nlg1 ΔC55 a fost atât de difuză, dinamica de grup din această mutante nu a putut fi analizate. În contrast, Δ C4 mutante au aratat libera similare (medie viteza de 11.51 ± 2.19 μ minute m / şi 6,5% din clustere sunt mobile, n = 10 celule) pentru a sălbatic de tip GFP-Nlg1 (11.24 ± 1,3 μminute m /, n = 11 celule, P > 0,5). Aceste rezultate sugerează faptul că o interacţiune prin legarea PDZ motivul nu este necesar pentru Nlg1 concentrarea sau motilitatea.

Acumularea de Nlg1 la site-uri de contact axodendritic

În ciuda presupunerea generală că funcţia de Nlgs acumulează rapid la site-uri de contact axodendritic [20], cursul ora exactă de Nlg1 acumulare la nivelul sinapselor curs de formare nu a fost raportată. Pentru a rezolva această problemă, dinamica Nlg1 au fost examinate în timpul formării unui contact stabil între dendritele a GFP-Nlg1-transfectate neuroni şi conuri de crestere axonala apropiere, non-transfectate neuroni sau neuroni transfectate cu mCherry pentru vizualizare (Figura2 ; fişiere suplimentare2 şi3). Toate experimentele au fost efectuate între 4-6 div, o perioadă când contactele axodendritic sunt frecvente şi formarea sinapselor este doar incepand cu aceste culturi. Imaginile au fost colectate de la fiecare e 25 pentru 1-2 ore, care este intervalul minim interframe că menţine starea de sanatate a neuronilor minimizand in acelasi timp fotooxidare în timpul perioadelor lungi de imagini necesare pentru a capta date de contact axodendritic curs de formare şi stabilizarea acestora.

Nlg1 acumulate la site-uri de contact axodendritic cu o gamă largă de cursuri de timp în care par să se împart în trei categorii: acumulare rapida in cateva secunde; acumularea mai lent peste minute; şi acumularea de la un site care conţinea deja un cluster Nlg1. De acumulare a fost definit printr-o creştere în intensitate a unui cluster de proteine, care a fost deasupra fundal dendritice medie plus o abatere standard. Din prima categorie, GFP-Nlg1 acumulate la site-uri de contact axonala în termen de o medie de 75 s (n = 5 stele din evenimentele de la 9), după conul de creştere a format prima un contact stabil cu dendrite. Într-un astfel de exemplu (figura2A), acumularea de Nlg1 au avut loc în termen de 50 s (două cadre imagistica) după contact. Deşi se pare că Nlg1 acumulate la aceste site-uri de contact de la piscina difuză, este posibil ca am ratat recrutarea rapidă a unui cluster Nlg1 la acest site, care poate au avut loc în cursul intervalului interframe 25 s. În câteva cazuri, conul de crestere axonala explorat dendrite si a atins tranzitor mai multe pre-existente, GFP-Nlg1 stabil clustere, dar în toate cazurile Axon format un contact stabil cu site-ul de la care noi Nlg1 clustere a apărut, după cum se arată în figura2A. Acumulare mai lentă a Nlg1 la contacte axodendritic curs de formare, care apar într-un interval de timp de minute, mai degrabă decât de secunde, a fost observat în două din cele nouă exemple (Figura2B). În cadrul acestei a doua categorie, Nlg1 clustere acumulate la persoana de contact în termen de 8.1 minute, în medie, după contactul iniţial. Deşi de data aceasta pentru sosire după contact este foarte asemanatoare cu durata de timp pentru recrutarea de NMDAR la noi sinapse [7], este posibil ca această medie ar fi diferită dacă un număr mai mare de contacte au fost incluse în eşantion relativ modeste. Din toate evenimentele observate de contact, Nlg1 acumulate la site-uri de contact în cadrul axodendritic 3.03 minute, în medie, (n = 7). În cele din urmă, în plus faţă de recrutare la noi sinapse, Nlg1 grupuri au fost, de asemenea, recrutaţi pentru a pre-existente, site-uri de contact axodendritic (n = 2; Figura2D).

În mai multe cazuri (patru stele din evenimente de contact nouă), GFP-Nlg1 acumulare la site-uri de contact axodendritic a fost urmată de extinderea rapidă a unui filopodium din ramura de dendritice principal de-a lungul Axon contact. În fiecare dintre aceste cazuri, un cluster Nlg1 mutat cu filopodium, grupate la vârful acesteia (Figura2C). Aceste filopodia în cele din urmă sa oprit în creştere de-a lungul Axon şi a rămas staţionar de la acest site cu nici o prelungire filopodial suplimentare pentru restul de imagistica (de până la 2 ore). În general, rezultatele noastre sugereaza ca Nlg1 pot fi recrutati pentru site-uri de contact cu axonilor, fie rapid, în câteva secunde, sau mai lent, în câteva minute. Deşi a fost presupus că Nlg1 de acumulare este unul dintre primele evenimente în synaptogenesis, rezultatele noastre sunt prima demonstratie directe pe care în timp a Nlg1 acumulare la site-uri de contact axodendritic este destul de rapid pentru a susţine ipoteza că este critică pentru inducerea formării de PSD.

Patching de NLG

Deoarece probabilitatea de a observa formarea de contacte stabile axodendritic între neuroni de cultura este prohibitiv de scăzut, o metodă alternativă a fost dezvoltat pentru a suprafaţă totală NLG într-o manieră rapidă şi fiabilă pentru a investiga dacă grupare rapidă a Nlg1 induce acumularea de proteine postsynaptic. Această metodă constă într-un test cu ajutorul unui patch solubil ligand endogen pentru a Nlgs cluster sau Nlg1 recombinantă. În timp ce acest test nu poate imita exact interacţiunile NLG cu ligand sale presinaptici β -NRX pe un axon contact, ea nu produce NLG agregare prin interacţiuni cu β -NRX pe secţiuni naivi de dendrite, care a fost propus să fie una dintre primele măsuri în synaptogenesis[20]. Mai mult decât atât, acest test are avantajul de a studia în urma evenimentelor din aval agregarea Nlgs, care poate fi numai una din mai multe interactiuni moleculare care au loc la date de contact axodendritic. O metodă similară a fost utilizată cu succes pentru a demonstra suficienţa de β -NRX, ligand presinaptic de Nlgs, în recrutarea vezicule sinaptice [25]. Am folosit neuroni de cultura, corticala pentru aceste experimente la 3-5 div, deoarece acestea sunt bine diferenţiat, dar au putine sinapse pe dendritele lor la aceste varste[7] şi prezintă, astfel, un substrat naiv pentru peticirea Nlg1 induse artificial.

Pentru a patch-uri NLG, neuronii au fost incubate cu un oligomerized β -NRX1-umane, proteină de fuziune Fc IgG (β -NRX-Fc; Figura3A). Această proteină de fuziune legat la suprafaţa atât non-transfectate şi GFP-Nlg1-transfectate neuroni (Figura3B, C), probabil prin intermediul Figura obligatorii pentru Nlg1 endogene si recombinant, deoarece acest tratament cauzat difuze GFP-Nlg1 pentru a deveni patch-uri (3C). După 60 de minute de patching, 76.7 ± 2,1% din GFP-Nlg1 clustere au fost colocalized cu β -NRX-FC (n = 26 neuroni). Fixarea şi etichetarea de neuroni, la diverse ore după adăugarea de oligomerized β -NRX-FC a demonstrat că legarea de β -NRX-Fc pentru membranele neuronale a fost rapid (Figura3C, D). Patching a GFP-Nlg1 a ajuns la 73% din maxim, în primele 5 minute de incubare (Figura3D) şi NLG endogen a fost peticit în non-transfectate celule cu un curs de timp similară (datele nu sunt prezentate).

Având în vedere că β -NRX1 se poate lega la Nlgs 1, 2, 3 şi 4, precum şi la mai multe forme de lipitură Nlg1 [19, 35], Nlg1 recombinant a fost special grupate transfecting de neuroni cu GFP-Nlg1 şi perioada de incubaţie aceste neuroni vii cu un anticorp oligomerized la GFP (Figura3A).Prin această abordare, GFP-Nlg1 a fost grupate cu un curs de timp similar cu tratamentul cu β -NRX-FC (fişier adiţional1). Aproximativ 66,5% din difuze, de suprafaţă GFP-Nlg1 este introdusă în patch-uri noi sau adăugate la grupuri existente, deoarece intensitatea medie a difuze GFP-Nlg1 a scăzut de la 5,8 ± 0.7 la 1.9 ± 0,2 unităţi de control şi fluorescenţă între neuroni patch-uri (P<0,0001, n = 7). De distribuţie a peticit Nlg1, folosind ambele metode, se asemăna cu distribuirea de Nlg1 în neuroni mai maturi într-un moment când multe sinapse au fost stabilite (10 div şi mai târziu; vezi mai jos).

NLG patching creşte dramatic PSD-95 clustering

Pentru a determina dacă NLG patching duce la acumularea de proteine postsynaptic aşa cum a fost propus să facă în timpul formării de PSD, de distribuţie a PSD-95 înainte şi după Nlgs endogen patch-uri a fost examinat. Incubarea de neuroni div 3-5 corticala cu oligomerized β -NRX-FC timp de 1 oră a crescut densitatea de PSD-95 clustere cu aproximativ 66% (de la 1.65 ± 0,15 clusters/20 μ m de dendrite la 2,5 ± 0,15, n = 16 neuroni, P <0,004; Figura4A-E). Multe PSD-95 clustere (56,7 ± 2,6%) colocalized cu β -NRX-FC patch-uri (Figura4C). Aceasta este o creştere de 75% peste numărul de PSD-95 grupuri care colocalized cu β -NRX-FC atunci când β -NRX-FC a fost aplicată după neuroni au fost imobilizate (32,3 ± 4,1%, n = 16 neuroni, P<0,0001). Cursul de timp a PSD-95 clustering rămas considerabil în urma inducerea rapidă de patch-uri NLG (Figura3D), deoarece nici un efect asupra PSD-95 densitate de grup a fost observat la 30 de minute (1.76 ± 0.18 clusters/20 μ m la 1.63 ± 0,17, n = 16 neuroni, P > 0,5; Figura4D). Cu toate acestea, PSD-95 de acumulare de la patch-uri NLG a atins maximul între 30 minute şi 1 oră. Acest curs de timp este, în general, în concordanţă cu experimente în cultura neuroni hippocampal incubate cu β -NRX-FC-filmate margele[23].

Întârzierea în PSD-95 clustering după patching NLG indică faptul că PSD-95 nu este recrutat imediat printr-o interacţiune constantă şi directă cu NLG. Rezultatele noastre sugerează faptul că în locul PSD-95 de acumulare de la patch-uri NLG este mediată de un pas intermediar, probabil un mecanism pe baza de enzime de semnalizare. Datorită faptului că PSD-95 necesită palmitoylation a celor două reziduuri de cisteina amino-terminale pentru localizare sinaptice [36], am testat dacă următorul palmitoylation influenţează capacitatea de PSD-95 de a fi recrutat pentru grupuri NLG. Inhibarea palmitoylation cu 2-bromopalmitate (15 μ M pentru 12 ore), blocat complet de inducţie de suplimentare de PSD-95 clustere de patching NLG (1,77 ± 0,53 clusters/20μ m dendrite la 1.62 ± 0,1, n = 17 neuroni, P > 0.18; Figura4E). Deşi este important să subliniem faptul că un număr mare de proteine sinaptice sunt palmitoylated[37], datele noastre sunt în concordanţă cu interpretarea pe care acumularea de PSD-95 de la patch-uri NLG reprezintă un pas palmitoylation-dependente, similar cu acumularea de PSD-95 de la sinapselor[36].

În continuare, dinamica NLG induse de PSD-95 clustere a fost determinată cu ajutorul time-lapse imagistica. Cuplu neuroni corticala (4 div) au fost transfectate cu PSD-95-GFP şi, după 12 ore, lamelă de acoperire a fost montat pe un microscop confocal şi neuronii au fost incubate cu oligomerized β -NRX-Fc a Nlgs grup endogen. Imagini dobândite pe parcursul următoarelor 75 minute evidenţiat apariţia unor noi PSD-95-GFP clustere (Figura4F). Acest curs lungi de timp a fost ales ca aceste experimente au fost efectuate la temperatura camerei, în timp ce în patching anterioare experimente a fost efectuat la 37 ° C. Analiza intensităţilor fluorescenţei în locuri în care grupurile au fost prezente în orice moment în timpul imagistica ne-a permis să împartă locurile în patru categorii: locatii, la care a grupat GFP a fost prezent în perioada de imagistica întregul (constant); locatii, la care clustere nu au fost prezenţi la începutul experimentului (apar); locatii, la care clustere nu au fost prezenţi în ultima imagine a seriei (dispar); şi locaţiile în care grupuri a apărut şi apoi a dispărut în timpul perioadei de formare a imaginii (Figura4G). Această ultimă categorie au reprezentat doar 4,7% din locaţii şi nu a fost evaluată în continuare.

Comparaţie de PSD-95-GFP-transfectate neuroni incubate cu oligomerized β neuroni-NRX-FC şi transfectate incubate numai cu anticorp secundar a demonstrat că numărul de clustere, care a apărut a fost majorat de aproape 40 de ori de patch-uri de NLG (de la 1 grup pe celula la 37,2 ± 6.24, n = 5 neuroni pe condiţie, P <0,02; Figura4H). În schimb, numărul de clustere constantă şi să dispară nu a fost afectată de NLG patching cu β -NRX-Fc (P > 0,5; Figura4H). Astfel, live-imagistica experimente confirmă faptul că legarea de β -NRX este suficientă pentru a iniţia formarea de novo PSD-95 clustere, cu un curs de timp relativ lent de aproximativ 1 oră.

Nlg1 este suficientă pentru a induce PSD-95 clustering

Având în vedere posibilitatea de a β -NRX1 legarea de Nlgs multiple în non-transfectate neuroni [19, 35], am examinat dacă GFP-Nlg1 specific patching-ului recombinant, cu un anticorp anti-GFP este suficient pentru a induce PSD-95 clustering. Tratamentul GFP-Nlg1-transfectate neuroni cu oligomerized anti-GFP anticorpi a crescut densitatea de PSD-95 clustere cu 31% (P <0,02; Figura5A, B). Pentru a testa dacă Nlg1 patching a provocat formarea sau demontarea "adevărat" sinapse, neuroni au fost immunostained cu anticorpi la transportator glutamat veziculoase 1 (VGlut1) de a eticheta terminale glutamatergic, presinaptic, PSD-95 pentru a eticheta PSD, şi GFP pentru a vizualiza patch-uri GFP-Nlg1; sinapse au fost definite ca situri colocalized de VGlut1 şi PSD-95[7]. Densitatea de terminale presinaptic sau synaptically localizate PSD-95 clustere nu a fost schimbat după Nlg1 patching (1,3 ± 0.16 VGlut1 clusters/20 μ m înainte şi 1.39 ± 0,2 după, şi 0.032 ± 0.006 sinaptice PSD-95 clusters/20 μ m înainte de a 0.029 ± 0.005 după; n = 13, P > 0,4). Cu toate acestea, densitatea de non-sinaptice PSD-95 grupuri a crescut cu 42%, după 1 oră de patch-uri cu anticorpi anti-GFP (1,5 ± 0.11 clusters/20 μ m la 2,14 ± 0,21, n = 13, P <0,02; Figura5B). Multe PSD-95 clustere colocalized cu patch-GFP-Nlg1 (63,5 ± 5,5%). Patching de Nlgs endogene şi Nlg1 recombinant cauzat efecte similare asupra recrutării de PSD-95, care indică faptul că GFP-Nlg1 supraexprimarea nu au cauzat acest rezultat. Aceste date sugerează că Nlg1 patching induce acumularea de PSD-95 în primul rând la site-uri extrasynaptic, cum era de aşteptat datorită naturii a testului patching. În general, aceste rezultate demonstrează că patch-uri de Nlg1 este suficientă pentru a clusterului PSD-95 în decurs de 1 oră.

PSD-95 se leaga de motivul carboxi-terminal PDZ obligatoriu de Nlg1 prin intermediul domeniu treia PDZ [31]. Pentru a examina dacă această interacţiune directă este necesară pentru NLG-induse de PSD-95 clustering, carboxi-terminal GFP-Nlg1 mutanţi Δ C4 şi Δ C55 au fost reparate în neuroni div 4-5 corticala (Figura1D). Eliminarea a jumătate din domeniu intracelulare de Nlg1, inclusiv motivul PDZ obligatoriu şi domeniul interacţiunii WW (Δ C55), a blocat efectul de patching NLG pe de grupare a PSD-95 (1.51 ± 0.17 clusters/20 μ m, n = 13, P > 0,5; Figura5C).Eliminarea de doar ultimii patru aminoacizi (Δ C4), motivul PDZ obligatoriu de Nlg1, a abrogat, de asemenea, efectul de Nlg1 colare pe PSD-95 clustering (1,57 ± 0.14 clusters/20 μ m, n = 13,P > 0,9; figură5C). Astfel, capacitatea de dispersie a Nlg1 PSD-95 necesită în mod specific domeniul PDZ obligatoriu de Nlg1.

Nlg1 patching nu afectează distribuţia receptorilor NMDA

Având în vedere că PSD-95 se leagă direct la NMDARs [10, 11], ar putea recruta Nlg1 NMDARs la noi sinapse prin interacţiunea cu PSD-95. Pentru a testa dacă patching NLG NMDARs grupate într-un mod similar cum a făcut-o PSD-95, neuronii tineri corticala (3-5 div) au fost immunostained cu un anticorp impotriva NR1 înainte şi după 1 oră de patch-uri, fie cu β -NRX-Fc sau anti- GFP-anticorpi. Surprinzator, patching de Nlgs endogene sau GFP-Nlg1 nu sa modificat semnificativ densitatea globală a NR1 clustere (1,66 ± 0.24 clusters/20 μ m la 2,27 ± 0.36, n = 16 neuroni, P > 0.15; Figura6A, B) sau densitatea de non-sinaptice clustere NR1 (1,13 ± 0.14 clusters/20 μ m până la 1,29, n = 16, P > 0.4; Figura6C ; non-sinaptice a fost definit ca NR1 care nu au colocalize cu proteine vezicula sinaptică VGlut1). Astfel, în contrast cu efectele sale asupra grupare a PSD-95, NLG patching nu modifică distribuţia de NMDARs.

Mai degrabă decât provocând formarea de novo acumulări de NR1, este posibil ca NLG patching ar putea provoca acumularea suplimentară de NR1 la pre-existente clustere NR1. În concordanţă cu această idee, Nlg1 patching a determinat o creştere a intensităţii fluorescenţei clustere NR1, dar numai în locaţii sinaptice (35,2 ± 12,5%, n = 20 neuroni, P <0,05; Figura6D ; synaptic NR1 este definită ca fiind clustere NR1 colocalized cu vGlut1). Această creştere a fost blocat de incubare cu inhibitor de palmitoylation 2-bromopalmitate (Figura 6D). Astfel, Nlg1 patching recruţi NMDARs suplimentare faţă de sinapse existente, printr-un pas palmitoylation-dependente.

Colocalization de receptori NMDA si Nlg1

La o examinare atenta, o mare parte din ambele NR1 non-sinaptice şi a fost în mod clar sinaptice colocalized cu patch-uri de GFP-Nlg1 (56,2 ± 8,4%, n = 11 neuroni; Figura 6A, B). Spre deosebire de PSD-95, colocalization de NR1 şi Nlg1 fost, de asemenea aparent pentru clustere de GFP-Nlg1 înainte de patch-uri (51,3 ± 9,3%, varfuri de sageti in figura6A panouri, stânga), sugerând că ar putea exista o interacţiune fizică între Nlg1 şi NMDARs înainte şi în timpul formării sinapselor. Pentru a testa această posibilitate, neuronii cultură cortical au fost immunostained cu anticorpi specifici pentru a Nlg1, NMDAR subunităţi 2A şi 2B (NR2A / B) şi VGlut1 la vârste cuprinse 4-15 div (Figura7A). Nlg1 a fost găsit în toate dendritele de neuroni piramidal la toate vârstele examinate în grupuri distincte clar vizibile de mai sus un fundal difuz. Densitatea totală a Nlg1 grupurilor nu au crescut semnificativ între 4 şi 15 div (2.61 ± 0.5 - 3.65 ± 0,4 clusters/20 μm dendrite, n = 10 neuroni / punct de timp, P > 0.12; Figura7B). În schimb, numărul de VGlut1-pozitive terminale presinaptici găsite pe dendritele, care a fost foarte scăzută la 4 div (0,96 ± 0,2 clusters/20 μ m dendrite), a crescut de aproape 5 ori, până la 15 div (4,65 ± 0,45 clusters/20 μ m dendrite, n = 10 neuroni / punct de timp, P <0,00001; Figura7C). Aceste rezultate indică faptul că grupuri de Nlg1 sunt prezente în dendritele înainte de marea majoritate a sinapselor au format, similar cu un raport recent arată prezenţa grupurilor de Nlg1 la ambele site-uri sinaptice şi non-sinaptice in neuroni hippocampal la varste mai mari[13].

În conformitate cu ipoteza noastra, majoritatea Nlg1 clustere colocalized cu NR2A / B (Figura 7A); 66,5% ± 6.0 din Nlg1 clustere colocalized cu NR2A / B, la 4 div, cu mult înainte de vârf de synaptogenesis (între 7 şi 10 div). In mod surprinzator, acest procent nu a crescut semnificativ in timpul dezvoltarii in vitro (76,6 ± 3,9% la 15 div, P > 0,2, n = 9 neuroni / punctul de timp). NR2A / B grupuri au aratat, de asemenea, nici o creştere, în măsura în care de colocalization cu Nlg1-a lungul timpului, în cultură, variind de la 62,4 ± 8,3% la 4 la 50.5 div ± 5,5% la 10 div (P > 0.4, n = 9 neuroni / punct de timp). Cu toate acestea, numărul de clustere de Nlg1 şi NR2A / B în apoziţie în apropiere de VGlut1-pozitive terminale crescut aproape de 4 ori între 4 şi 15 div (0,6 ± 0.12 - 2.19 ± 0.21 clusters/20 μ m dendrite, P <0,00001, n = 9 neuroni / moment de timp; Figura7C). Concomitent, proporţia de colocalized NR2/Nlg1 clustere de la non-sinaptice locaţii a scăzut de la 60,7% ± 7.0 la 4 div la 20,6% ± 3,9 la 15 div (n = 9 neuroni / punct de timp, P<0,0005; Figura7B). Aceste date sugerează că Nlg1 endogene şi NMDARs sunt adesea colocalized înainte de formarea synapse şi sunt fie recrutaţi la terminale postsynaptic sau împreună cu cinetică similare.

De transport de Nlg1 cu receptorii NMDA

Colocalization ridicat de Nlg1 cu NMDARs a sugerat ca aceste proteine pot fi recrutaţi împreună pentru a sinapselor curs de formare, poate la fel de clustere mobile data vazut in experimentele anterioare (Cifre 1C şi2)[7, 9]. Dacă este aşa, atunci Nlg1 şi NMDARs ar trebui să fie traficate împreună în dendritele de neuroni de cultura corticale înainte de synaptogenesis. Pentru a examina dacă Nlg1 clusterele sunt traficate cu NMDARs, 4-5 neuroni div cortical au fost transfectate cu ambele PCP-Nlg1 şi NR1-DsRed, şi sonda 12-14 ore mai târziu (Figura8A, B ; fişier suplimentare4). Aşa cum a prezis din imunocolorarea, majoritatea de PCP-Nlg1 şi NR1-DsRed clustere au fost colocalized: 53.9 ± 6,8% din PCP-Nlg1 a fost colocalized cu NR1-DsRed, în timp ce 63.7 ± 8,0% din NR1-DsRed a fost colocalized cu PCP-Nlg1. Time-lapse fluorescenţă imagistica a arătat că 69.7 ± 9,5% din mobil PCP-Nlg1 clustere au fost colocalized cu NR1-DsRed, în timp ce 76.1 ± 10,4% din mobil NR1-DsRed (NRTPs) au fost colocalized cu PCP-Nlg1 (un total de 188 grupuri analizate de la 11 celule transfectate). Astfel, majoritatea NRTPs sunt co-transportate cu clustere de Nlg1.

Analiza cineticii de NRTPs şi Nlg1 relevat două bazine distincte de clustere mobile NLG: clustere care conţin atât NR1 şi Nlg1 sa mutat la o viteza medie de 8,8 ± 1,1 μ m / minut, o viteză care se aseamana mult observatiile noastre anterioare, pentru NRTPs (8,5 ± 1.8 μ m / minut; Figura8C)[9]. În schimb, grupuri de Nlg1 singur sa mutat la o viteza medie de 14.9 în jurul valorii de ± 2,8μ m / minut (n = 10 neuroni, P <0,02; Figura8C, D). Analiza detaliată a time-lapse filme a arătat că aceste două bazine de NLG sunt dinamice, care este, asocierea dintre NLG şi NRTPs a fost ocazional tranzitorie. În 5 stele de 188 de clustere analizate, am observat NR1-DsRed clustere se deplasează între imobil PCP-Nlg1 clustere (Figura9A). În plus, grupuri de PCP-Nlg1 mutat să se alăture unui grup de NR1-DsRed şi apoi sa mutat, împreună cu faptul că NRTP (2 de 188 de clustere; Figura9B). În acelaşi neuron, a fost posibil pentru a vedea NR1-plus clustere Nlg1-pozitiv se deplaseaza cu viteze medie de 6,5 μ m / minut (n = 4), în timp ce două NLG-doar clustere medie de 12.8 μ m / minut. Astfel, NRTPs şi grupări NLG nu sunt întotdeauna strâns asociate în timpul circulaţiei şi Nlg1 pot utiliza un alt mod de transport atunci când nu este asociat cu NMDARs. În general, aceste date sugerează o interacţiune semnificativă, dar labilă, între NRTPs şi Nlg1.

NLG patching scade dramatic de mobilitate NLG şi NRTP

Pentru a investiga efectul NLG colare privind motilitatea NRTPs, 4-5 neuroni div cortical au fost cotransfected cu PCP-Nlg1 şi NR1-DsRed. Doisprezece la 14 ore mai tarziu, neuronii transfectate au fost incubate cu oligomerized β -NRX-Fc pentru între 60 şi 80 de minute înainte de time-lapse microscopie de fluorescenta (Figura9C). Neuroni transfectate de control au fost incubate cu anticorpi secundar numai. Analiza de time-lapse filme a arătat că Nlg1 patching a determinat o reducere 6.25 ori în număr de mobil PCP-Nlg1 (de la 11 ± 1,8% la 1,76 ± 0,4%, n = 11 neuroni,P <0,002). Acest efect a fost paralel cu o reducere de 3,4 ori, în procent de mobil NR1-DsRed grupuri (de la 33,7 ± 5,7% la 9.85 ± 1,6%, n = 11 neuroni, P <0,0002; Figura9D). Această scădere a mobilităţii de NRTPs sugerează că fracţiunea în mod normal, foarte mobile de clustere NMDAR este imobilizat la grupuri de suprafaţă Nlg1 de patching.

Asociaţie biochimice de NLG cu NRTPs

Având în vedere colocalization şi co-de transport de NLG clustere cu NRTPs, am investigat lângă natura biochimice ale interacţiunii lor. În primul rând, am determinat dacă NLG şi NMDARs legat unul pe altul în cortexul postnatale înainte de începutul anului cea mai mare parte a synaptogenesis apare. În concordanţă cu această idee, anticorpi atât NR2B şi Nlgs co-immunoprecipitated Nlg1 NR1 şi, respectiv, de la membrane solubilized din cortexul de şobolan P4 (Figura 10A). Interacţiunea dintre Nlg1 şi NMDAR specifice, deoarece a fost sinaptice vezicula proteine synapsin1 şi AMPA (α -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic acid) receptorilor (AMPAR) subunitate GluR2 nu au fost co-immunoprecipitated cu aceste anticorpi (Figura10B), precum şi expunerile prelungite de aceste pete de vest nu au condus la etichetarea pozitiv de immunoprecpitations fie cu NLG sau anticorpi NR2B (nu apare pe site).

Aceasta asociere biochimice ar putea apărea între Nlg1 şi NMDARs la non-sinaptice site-uri sau la nivelul sinapselor puţinele deja prezente în cortexul postnatale timpurii. Pentru a determina dacă Nlg1 se leagă în mod specific la NRTPs, NMDAR care conţin izolate, au fost preparate dintr-o fracţiune membrană uşoară de la P2-3 şobolan cortexul[38, 39] prin utilizarea unui anticorp anti-NR1 conjugat cu margele magnetice (Dynabeads). După spălare extinse, imuno-izolate au fost analizate prin electroforeză în gel şi immunoblotting (Figura10C). Imuno-izolate conţinute NR1 şi NR2B, cum era de aşteptat. Pentru a caracteriza îmbogăţire, am cuantificat intensităţile pixelilor în pete de vest şi a calculat procentul de proteină totală de intrare, care a fost recuperat în fracţiunea imuno-izolat. Am recuperat 27.2 ± 7.8% din total şi 18,9 ± NR1 6,6% din totalul NR2B în imuno-izolat (n = 7 experimente). Important, imuno-izolate s-au îmbogăţit pentru Nlgs (determinată cu ajutorul unui anticorp pan-NLG; 15.2 ± 2,6% din intrare, n = 7). Analiza cu anticorpi specifici la Nlgs 1, 2 şi 3, a arătat că toate cele trei Nlgs au fost prezenţi în aceste imuno-izolate (7,7 ± 1,7%, 3,9 ± 2,9% şi 4,5 ± 3,1% de intrare, respectiv; Figura10C). În concordanţă cu această idee, mai multe studii sugerează că Nlgs 2 şi 3 pentru a localiza şi a sinapselor glutamatergic GABAergic[24, 40, 41]. Cu toate acestea, unele studii sugerează că nu este Nlg2 asociate în mod specific cu sinapse GABAergic[42]. Nlg4 nu a fost analizat, deoarece nu este exprimată în acest moment în dezvoltare[29]. Acest lucru sugerează că Nlgs mai multe se pot asocia cu NRTPs în timpul traficului la sinapse.

Am analizat apoi imuno-izolate pentru a detecta prezenţa de kinaze membranei asociate guanilat (MAGUKs), care mediaza potenţial de interacţiune NLG-NMDAR. Cuantificarea blots de Vest a demonstrat că SAP102, PSD-95 şi S-SCAM au fost recuperate în imuno-izolat (6,6 ± 2,0%, 6,8 ± 1,6% şi 5,3 ± 2,3% din cantitatea totală, respectiv, n ≥ 5; Figura10C). Această recuperare a fost semnificativă, deoarece sinaptice vezicula proteina VGlut1 nu a fost prezent în NR1 imuno-izolate membrane (-1,9 ± 5,3%, P <0,05, n = 4; Figura10C). Deşi aceste experimente nu pune în lumină stoichiometrie de proteine asociate cu NRTPs intensitate, deoarece etichetarea este determinată de afinitate anticorpi, ele sunt în concordanţă cu încheierea de imagistica si imunocitochimie că NMDARs şi Nlg1 fizic sunt asociate una cu cealaltă şi transportate împreună în dendritele în timpul synaptogenesis, probabil prin intermediul interacţiune cu o proteina MAGUK.

În studiile anterioare, am demonstrat că 28% din NMDARs mobile sunt asociate cu AMPARs [7].În ciuda faptului că în imposibilitatea de a co-immunoprecipitate subunitatea AMPAR GluR2 cu un anticorp fie NR2B NLG sau de la detergent-solubilized creierului (Figura10B), am considerat posibilitatea ca GluR2 ar putea fi, de asemenea prezentă în nostru de imuno-izolate fracţiunea membrană NRTP. Într-adevăr, de Vest sugativa şi cuantificare a demonstrat o îmbogăţire semnificativă a GluR2 şi de aceste fracţiuni (18,2 ± 1,0% de intrare, n = 3; Figura 10C). Acest lucru sugerează că, deşi nu există nici o interacţiune directă între NMDARs şi AMPARs sau între Nlgs şi AMPARs în acest moment în dezvoltare (Figura10B), AMPARs sunt prezente în cadrul imuno-NRTPs izolate. În timp ce îmbogăţirea AMPARs pot apărea mai puternică decât cea observată pentru oricare dintre proteinele asociate, este important să se ia în considerare faptul că aceste imuno-izolatii sunt de membrane intacte, care va include AMPARs, întrucât proteinele MAGUK şi Nlgs sunt periferic asociate (a se vedea mai jos) şi, prin urmare, pot fi mai puţin eficient co-izolate.

Asociaţia biochimice de Nlgs cu NRTPs ar putea avea loc prin intermediul a trei mecanisme posibile: Nlgs ar putea fi asociate integral în cadrul membrana NRTP ca o componentă a unei proteine care conţin de transport multi-nucleu; Nlgs ar putea fi indirect asociate cu NRTPs prin legarea de NMDARs la un MAGUK, care, la rândul său se leagă Nlgs [43 - 45]; sau Nlgs ar putea fi atât în cadrul NRTPs şi asociat cu NMDARs. Dacă Nlg1 este prezent în NRTPs, dar nu în mod direct asociate cu NMDARs, apoi solubilizare a imuno-izolate cu detergent Triton X-100 ar trebui să împiedice recuperarea Nlg1. Cu toate acestea, solubilizare a imuno-izolate nu a schimbat îmbogăţire a Nlg1 (Figura10D). Am recuperat aceeaşi cantitate de NR1 în detergent-solubilized condiţii de (100 ± 24% din starea de control, n = 4), şi am recuperat 79 ± 30% din Nlg1 în prezenţa de Triton X-100 (n = 4; figură10D). Pentru a confirma faptul că membranele au fost, de fapt, fiind intrerupt in aceste conditii, am examinat GluR2 că nu a fost anterior co-immunoprecipitated în condiţii solubilizing (Figura10B). În concordanţă cu acest lucru, doar 15.3 ± 3,1% din GluR2 fost reţinute în NRTP imuno-izolat, în condiţii solubilizing comparativ cu membrane intacte (n = 2; Figura10D). Acest rezultat sugerează că Nlg1 punct de vedere biochimic interacţionează cu NMDARs şi nu este pasiv co-transportaţi în acelaşi organite.

Dacă Nlg1 este doar tangenţial asociat cu NRTPs, apoi o spalatorie pH-ul ridicat al NRTPs imuno-izolate ar trebui să elimine această interacţiune, deoarece acest tratament abroga interactiuni proteina-proteina, fără a compromite integritatea membranei organite-legat [46]. În acord cu această interpretare, expunerea de imuno-izolate NRTPs la pH ridicat (tampon carbonat, pH11) a eliminat îmbogăţire a Nlg1 (6,1 ± 22% din suma recuperată de la pH7.4, n = 4; Figura10E). În schimb, atât NR1 şi GluR2 au fost semnificativ mai îmbogăţit în condiţii de pH11 (141 ± 47% şi 66.4 ± 6,7% din suma recuperată de la pH7.4, respectiv, n = 4 şi 2; Figura10E). Împreună, aceste rezultate sugerează că Nlg1 nu este conţinută în cadrul NRTPs, dar este asociat cu ei, probabil prin intermediul adaptorului proteine, cum ar fi SAP102, PSD-95 sau S-SCAM.

Co-de transport de Nlg1 cu NMDARs necesită Nlg1 motivul obligatoriu PDZ

Pentru a testa ipoteza ca co-de transport de NLG şi NMDARs necesită domeniul PDZ a cozii citoplasmatice de Nlg1, 3-5 neuroni div corticala au fost co-transfectate cu text eliminat mutant NLG, GFP-Nlg1 Δ C4, lipsite de domeniu obligatoriu PDZ, împreună cu NR1-DsRed şi sonda 12-14 ore mai târziu (Figura11A, B). În conformitate cu ipoteza noastra, o reducere cu 40% în colocalization a fost observată între clustere NLG şi NR1 (de la 58.5 ± 1,3% la 35,1 ± 0,3%, n = 8 şi 15, respectiv neuroni, P = 0.0053; Figura11C). Time-lapse imagistica fluorescente relevat, de asemenea, o reducere de 66% în colocalization de mobil Nlg1 clustere cu NR1-DsRed (de la 61,6 ± 2,5% la 21,1 ± 1,0%, n = 6 neuroni fiecare, P = 0,001; Figura11C). Deşi un procent mic de colocalization Nlg1 şi NMDAR si co-de transport ar putea fi mediate prin părţi suplimentare ale cozii citoplasmatice a Nlg1, aceasta nu a putut fi testate din cauza cerinţei de acest domeniu pentru clustering NLG (Figura1E). În general, aceste rezultate indică faptul că motivul PDZ obligatorii conţinute în coada citoplasmatic de Nlg1 mediază în mod specific de cele mai multe colocalization si co-de transport de Nlg1 cu NMDARs, dar nu este crucială pentru Sediu sau mobilitatea NLG în sine [33] (Figura1).

Discuţie

Adeziune molecula pereche NLG celulă şi NRX pare a fi suficientă pentru recrutarea a două componente esenţiale ale PSD - NMDARs şi PSD-95 [19, 20, 23]. Astfel, sa propus ca un complex ternar între Nlg1, PSD-95 şi NMDARs ar putea media direct de recrutare NMDAR la sinapse curs de formare[32], deoarece PSD-95 se poate lega direct la ambele Nlg1[31] şi la NMDARs[10, 11]. Cu toate acestea, această ipoteză este dificil de conciliat cu date care arată că acumularea sinaptice ale PSD-95 are loc cu un curs de timp variabile în raport cu NMDAR de recrutare. În unele cazuri, PSD-95 de acumulare precede recrutare NMDAR[7, 8, 17, 47], în timp ce în alte cazuri, NMDARs sunt recrutaţi pentru a sinapselor curs de formare în absenţa PSD-95[7, 48]. Important, NMDARs nu necesită PSD-95 pentru recrutare la noi sinapse[7, 48], NMDARs nu necesită motivul PDZ legarea NLG pentru a localiza la sinapselor[24], şi NLG nu are nevoie de ei carboxi-terminale PDZ domeniu care urmează să fie direcţionate către sinapse [33]. Aici, am aratat ca Nlg1 pot recruta mai multe proteine postsynaptic a sinapselor în curs de formare prin mecanisme independente şi cursuri de timp.

În neuroni tineri corticala înainte şi în timpul synaptogenesis, Nlg1 este prezent în cel puţin patru bazine de suprafaţă distincte: difuze; imobil grupate, motili grupate şi motili grupate asociate cu NMDARs. Nu este clar cât de mult schimb există între bazine de suprafaţă Nlg1, dar imagistica noastră este în concordanţă cu posibilitatea ca contactul axonala duce spre o grupare de NLG difuze la nivelul sinapselor curs de formare (Figura 2). Analog, piscina difuze pot fi făcute pentru a agregat în patch-uri prin aplicarea o formă solubilă de ligand sale β -NRX. Clustere imobil de Nlg1 ar putea reprezenta un bazin de Nlg1 deja asociate cu PSD-95, care a fost demonstrat de a recruta pasiv terminale presinaptici[13]. Bazine de motile NLG cuprinde aproximativ 11% din clustere NLG, fiind transportate în dendritele la o viteza medie de aproximativ 15 μ m / minut.Clustere mobile NLG erau adesea observate la filopodia dendritice, introducerea NLG într-o poziţie perfectă pentru a media şi a stabiliza noi contacte axodendritic[49]. Cinetica NLG circulaţie cu dispersie pe care le-au măsurat diferi de ceea ce a fost raportate anterior[13]. Mobilitate nostru superior poate fi explicată prin vârsta de cultură (4 faţă de 7 zile), cu rata rapida a imaginilor în acest studiu (pana la 2 cadre pe secundă, comparativ cu 2 cadre pe minut) sau de sursa de culturi neuronale (cortexul versus hipocampus). Indiferent de diferenţele specifice, ambele rapoarte sunt consecvente în care arată că grupuri NLG sunt mobile şi, prin urmare, ar putea fi recrutaţi pentru sinapse curs de formare.

Acumularea de GFP-Nlg1 au avut loc rapid în urma contactelor axodendritic in neuroni tineri corticale. În majoritatea exemple, Nlg1 acumulate la date de contact incipient de axonala con filopodia creştere cu arbori de dendritice în doar peste 1 minut de contact stabilizată; aceasta este prima demonstratie directa de la Nlg1 acumulare de noi contacte între axonilor si dendritele, şi oferă dovezi pentru ipoteza în vigoare în domeniul nostru ca acumularea de un CAM este unul dintre primii paşi în urma unui contact axodendritic duce la formarea de o sinapsa curs de formare[1, 6]. Având în vedere calendarul de doar 1 minut, este tentant sa speculeze ca acest eveniment ar putea fi asociate cu fenomene tranzitorii de calciu recent descrise în timpul evenimentelor de contact axodendritic care s-au stabilizat in tesutul intact[50]. Treime din exemplele noastre au aratat o acumulare mai lenta a Nlg1 în termen de 8.1 minute, în medie, care este tocmai cursul durata medie de recrutare NMDAR la aceste tipuri de contacte[7]. În cele din urmă, Nlg1 de clustere pot fi, de asemenea, recrutati pentru a sinapselor existente, după formarea lor, oferind, probabil, de stabilizare suplimentare prin intermediul aderenţă sporită şi / sau recrutare de NMDARs mai mult. Luate împreună, aceste date sugerează că Nlg1 poate acumula la date de contact curs de formare în termen de secunde pentru a spori aderenta. În termen de minute de stabilizare a persoanei de contact, este recrutat Nlg1 suplimentare care ar putea determina NMDARs direct la site-ul de contact şi pentru a începe procesul de synaptogenesis.

Pentru ca vizualizarea recrutarea de proteine contin tag-ul la date de contact axodendritic este prohibitiv de low-randament, am dezvoltat un test de dispersie fiabil şi rapid NLG în membrana dendritice de neuroni tineri, cultură cortical. Avantajul acestui test este că aceasta poate dezvălui efectele oligomerizarea NLG endogene sau recombinant privind recrutarea de proteinele endogene postsynaptic cu rezoluţie temporală mare. Oligomerizarea NLG în neuroni tineri corticala înainte de vârf a crescut în mod dramatic synaptogenesis PSD-95 clustering. Acest rezultat este in concordanta cu rapoartele anterioare care demonstrează că PSD-95 este recrutat de site-uri de contact cu β -NRX a prezentat pe fiecare transfectate non-neuronale celule[20] sau filmate pe margele[19, 23]. Cu toate acestea, spre deosebire de aceste studii anterioare, am folosit time-lapse imagini pentru a caracteriza o sincronizare mai exactă şi mecanismul de PSD-95 de recrutare pentru noi Nlg1 grupuri. Deoarece β -NRX-NLG obligatoriu este potenţial unul dintre primele evenimente care duce la acumularea rapida de proteine postsynaptic a sinapselor naşte în câteva minute de contact între axonilor si dendritelor[1, 45], am investigat în mod specific cursul momentul recrutării de PSD-95 pentru a NLG oligomerized folosind testul nostru de patching. PSD-95 acumulate la grupările NLG între 30 şi 60 de minute după patch, un curs de timp în concordanţă cu cel observat pentru acumularea de PSD-95 de la sinapselor dintre neuroni în cultură[7, 12, 17, 23, 47, 51]. Recrutarea de PSD-95 patch-uri pentru a NLG a fost complet dependentă de domeniul PDZ de NLG şi pe palmitoylation, similare cu recrutare sarcina de a sinapselor[36]. Având în vedere influenţa puternică a PSD-95 privind recrutarea AMPAR la noi sinapse[36], o întârziere între 30 şi 60 de minute pentru PSD-95 sosire este, de asemenea, în concordanţă cu sosirea a receptorilor AMPA, care apare la 1-2 ore după un contact sinaptice[7,17, 23].

În contrast cu creşterea dramatică a densităţii de PSD-95 clustere, densitatea de clustere NMDAR a fost neschimbat patch-uri NLG text. Acest rezultat a fost surprinzător, deoarece rapoartele precedente au arătat că NMDARs sunt recrutaţi la site-uri de contact cu celule non-neuronale care exprimă β -NRX[20] si margele acoperite cu β -NRX în termen de 2-4 ore[19, 23]. Având în vedere aceste rezultate anterioare, am iniţial de aşteptat ca patch-urilor NLG ar putea creste de grupare a NMDARs. Cu toate acestea, deoarece NMDARs sunt prezente în NRTPs, recrutarea lor nu ar fi văzută ca o creştere a numărului la patch-uri de Nlg1. Desigur, este posibil ca grupuri noi NMDAR apar cu un curs de timp mai lung după NLG patch, dar patching NLG în mod clar nu duce la formarea de clustere NMDAR noi în 10 minute la 1 oră de timp în care sunt recrutaţi pentru a NRTPs sinapse curs de formare [7].

Deşi patching NLG nu a crescut densitatea de clustere NMDAR, NLG oligomerizarea a crescut intensitatea de colorare NMDAR la sinapselor existente într-un mod palmitoylation-dependent, ceea ce sugerează faptul că recrutarea NLG creşteri de NMDARs a sinapselor stabilit printr-o interacţiune cu o proteina palmitoylated, probabil PSD-95. Acest rezultat este în concordanţă cu observaţia că domeniul de PDZ NLG este necesar pentru NLG mediate de dezvoltare a curenţilor NMDAR la sinapselor[20], şi Nlg1 este necesar pentru un stadiu tardiv activitate dependentă de maturare a curenţilor NMDAR [28].

Poate ca rezultatul cel mai surprinzator in acest studiu a fost că sunt foarte NMDARs colocalized cu NLG clustere înainte de sinapse sunt formate şi NRTPs mobile au o tendinţă mare de a călători cu clustere NLG. Aproximativ 70% de pe telefoane mobile Nlg1 clustere sunt co-transportate cu NRTPs. NRTPs pot interacţiona stabil sau tranzitor cu Nlgs 1, 2 şi 3 în timpul transportului şi Nlgs colare reduce dramatic mobilitatea acestora. In timp ce noi nu ştim încă precis legăturile moleculare dintre Nlgs suprafaţă şi NRTPs, rezultatele noastre sunt în concordanţă cu ipoteza că această interacţiune este mediată de către traficul de proteine, cum ar fi schele SAP102, S-SCAM sau PSD-95. În primul rând, aceste proteine sunt prezente pe schele imuno-izolate NMDAR care conţin organite şi se leagă atât NMDARs[10, 11, 52 - 54] şi Nlg1[31, 43, 44]. NRTPs În al doilea rând, sunt foarte mobile colocalized cu SAP102[9] şi Nlg1 (Figura7) şi NMDARs sunt puternic asociate cu SAP102 în creier tineri[54]. Poate cel mai convingătoare, eliminarea carboxi-terminal PDZ domeniu (Δ C4) a scăzut dramatic colocalization şi co-de transport de Nlg1 şi NMDARs, fără a afecta concentrarea sau mobilitatea Nlg1 în monoterapie. Regiunea dintre ultimele 55 şi 4 amino-acizi care conţin domeniul WW, care se leaga S-SCAM[43] este suficientă pentru clustering şi de transport de Nlg1 şi poate intermedia cantitate mică de colocalization şi de co-de transport de Nlg1 NMDARs şi care rămâne în neuroni transfectate cu PDZ domeniu-lipsesc Nlg1 (Δ C4). Această compensaţie de domeniu WW ar explica de recrutare aparent normală a NMDARs în prezenţa Δ C4 mutant Nlg1 în timpul experimentelor supraexprimarea pe termen lung[24].

Mobilitatea NLG clustere si co-de transport de Nlg1 cu NRTPs a fost deosebit de surprinzător, deoarece NLG este în primul rând găsit în membrana plasmatice de neuroni tineri corticale (Figura1A). Folosind ambele cu acid de demontare şi teste biotinylation, ne-am aratat anterior ca suprafaţă NLG nu suferă endocytosis sau cu bicicleta, cu membrana plasmatice în termen de 30 de minute de anticorpi-obligatoriu în neuroni tineri corticala[9]. Suprafaţă-etichetare experimentelor de aici confirma în continuare Sediu suprafaţă de Nlg1 şi arată că colare folosind anticorpi GFP sau β -NRX nu induce internalizarea Nlg1 (fişier adiţional1). În contrast, ciclu NMDARs cu membrana de plasma în timpul transportului lor pe structuri eterogene tubulovesicular care se misca de-a lungul microtubuli intracelular[9]. Împreună, aceste rezultate implică faptul că grupurile de suprafaţă a NLG sunt co-transportate cu bicicleta şi NRTPs intracelulare. Mecanismele care stau la baza acestei co-de transport nu sunt cunoscute şi vor fi un subiect important pentru activitatea viitoare.

Observaţia că un CAM suprafaţă pot fi traficate cu un nucleu de transport intracelular este mai puţin frecventă, deşi nu fără precedent. Într-adevăr, suprafaţă NCAM formează un complex cu NMDARs în neuroni tineri printr-o legătură spectrin, această interacţiune a NRTPs cu NCAM este important pentru recrutarea de NMDARs a sinapselor curs de formare[55]. Presynaptically, suprafaţă NCAM, de asemenea, asociate prin spectrin cu organite intracelulare reţelei trans-Golgi[46] şi TrkB suprafaţă este co-transportat cu precursori veziculelor sinaptice[56]. Aici, am aratat ca suprafata Nlg1 este co-transportat cu NRTPs, probabil prin legarea de MAGUKs sunt posibile mai multe, inclusiv SAP102 sau S-SCAM. Luate împreună, aceste rezultate sugereaza un model nou pentru funcţia de CAM: CAM de suprafata pot fi legate prin intermediul proteinelor de schele citosolice la organite intracelulare de transport (Figura12). Oligomerizarea CAM suprafaţă, sau cu caracter obligatoriu de care CAM faţă de partenerii săi pe un axon presinaptic, ar duce apoi la acumularea de proteine sinaptice direct legate de CAM. În concordanţă cu această idee, patching NLG scade motilitatea NRTP, sugerând că legarea Nlg1 de către un terminal presinaptic ar cauza NR1 la pauză şi / sau opri la un nou site de contact prin intermediul asocierii sale fizice cu Nlg1.Acest model de Nlg1-dependente Sediu NMDARs de la site-uri noi de formare a sinapselor ar prezice o scadere a functiei NMDAR în Nlg1-deficit de rozătoare. Într-adevăr, NMDAR-mediată de transport sinaptice este scăzut la soareci knock-out Nlg1[29] şi NR1 expresiei este scăzut cu 23% în NLG şoareci triple knock-out (Nlgs 1, 2 şi 3)[29]. În plus, Nlg1 knock-down in amigdala a rezultatelor şobolani în memorie a scăzut frica asociative, un comportament dependent NMDAR[57].

Concluzie

Nlg1 se acumulează la date de contact axodendritic curs de formare cu un curs rapid de timp, plasându-se la locul potrivit şi de timp pentru a consolida proteine de adeziune şi recruta la PSD.Oligomerizarea NLG recrutează două proteine diferite postsynaptic - NMDARs şi PSD-95 - cu mecanisme distincte şi cursuri de timp. Acest lucru demonstrează că Nlg1 este suficientă pentrude novo şi formarea rapidă a PSD (dar a se vedea[28]). NMDARs sunt recrutati pentru site-uri de oligomerizarea NLG cu un curs de timp foarte rapid [7] printr-o interacţiune fizică cu NLG, mediată probabil de o proteina PDZ care conţin, cum ar fi SAP102. Acumularea de PSD-95 de la aceste site-uri apare cu un curs de timp mai lent şi este dependentă de palmitoylation. Mai târziu, pachete suplimentare de NMDARs pot fi adăugate la site-uri sinaptice stabilit printr-o recrutare NLG-dependentă a NMDARs asociate cu PSD-95 şi care necesită palmitoylation. Astfel, acumularea rapidă de Nlg1 la sinapselor curs de formare pare a fi esenţial în orchestrarea etape independente multiple în formarea sinapselor glutamatergic.

Materiale şi metode

Toate studiile au fost efectuate cu protocoalele aprobate atât din Universitatea de ingrijire a animalelor California, Davis şi Comitetul de utilizare şi Universitatea de ingrijire a animalelor Oregon şi Comitetul de utilizare, în conformitate cu orientările NIH pentru îngrijirea şi folosirea animalelor experimentale.

ADN-ul construieşte

PCP-Nlg1 a fost facuta de accizare Sal am GFP fragment din GFP-Nlg1 şi inserarea PCP amplificat cu primeri ca cea utilizată anterior pentru GFP-Nlg1[32]. GFP se referă la proteina verde fluorescentă consolidată (EGFP). Eliminarea din carboxi-terminal 4 (Δ C4) şi 55 (Δ C55) amino-acizi din Nlg1 a fost efectuat de către PCR şi confirmate de secvenţiere. NR1-DsRed a fost descris anterior[7]. pCDNA- β -NRX-FC a fost un cadou de la P Scheiffele (Biozentrum, Basel, Elveţia).PSD-95-GFP a fost un cadou de la Alaa El-Husseini.

Cultură neuronală şi transfections

Neuroni din cortexul şobolan au fost cultivate şi aurit pe monostraturi astrocyte la o densitate de 22 mm lamelă de acoperire K/18 [7]. Neuronii au fost transfectate cu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, Statele Unite ale Americii), astfel cum este descris anterior[9].Datele au fost colectate de la cel puţin două culturi distincte neuronale pentru toate experimentele.

Patching experimente

Pentru patch-uri de NLG endogen, o proteină de fuziune din domeniul extracelular al β -NRX şi umane Fc IgG a fost produsă de către celulele cu transfecting COS7 pCDNA- β -NRX-Fc. Mediu a fost trecut printr-o coloană de proteine-G-sepharose (Amersham, Piscataway, NJ, Statele Unite ale Americii) şi eluată cu glicina tampon pH2.7 şi concentrat la aproximativ 1 mg / ml. β -NRX-FC (0,01 mg / ml) a fost pre-incubate cu anticorpi anti-umane IgG (1:250; Chemicon, Temecula, California, Statele Unite ale Americii), în mediul neuronale timp de 15 minute la temperatura camerei. Neuronii au fost incubate cu acest mediu, pentru diferite perioade, clătite cu lichidul cefalorahidian artificiale[7] şi apoi sonda vii sau fixe pentru imunocitochimie. Pentru patching de GFP/CFP-Nlg1, policlonali anti-GFP anticorpi (1:750; Probes moleculară, Eugene, Oregon, Statele Unite ale Americii), au fost pre-incubate cu anticorpi anti-iepure secundar (1:3,000; Probes moleculară) în mediul neuronale pentru 15 minute la temperatura camerei. Neuronii au fost apoi incubate cu acest mediu, pentru diferite perioade, clătite cu lichidul cefalorahidian şi imagini artificiale sau prelucrate.

Imunocitochimie

Immunolabeling cu anticorpi anti-NR1 (54,1, 1:500; BD Biosciences PharMingen, San Diego, California, Statele Unite ale Americii) a fost efectuată aşa cum este descris [7] folosind metanol la -20 ° C timp de 10 minute ca fixativ. Toate celelalte imunocitochimie utilizate 4% paraformaldehidă, 4% zaharoză în soluţie salină tamponată cu fosfat-la 4 ° C timp de 10 minute ca fixativ. Coverslips au fost expuse la 0,25% Triton X-100 timp de 5 minute, blocat cu ser bovin 10% albumina în fosfat-soluţie salină tamponată şi incubate cu anticorpi primare şi secundare la 3% albumină serică bovină. Anticorpi primari au fost utilizate după cum urmează: Nlg1 (4C12, un anticorp specific pentru Nlg1, 1:400; N Brose), NLG (4F9, 1:500; Sisteme Synaptic, Gottingen, Germania), PSD-95 (K28/43, 1: 800; J Trimmer), VGlut1 (AB5905, 1:2,000; Chemicon, Temecula, California, Statele Unite ale Americii), NR2A (07 - 632, 1:500; Biotehnologie Upstate, Lake Placid, New York, Statele Unite ale Americii), NR2B (AB1557, 1:200; Chemicon), GFP (A11122, 1:2,000; Probes moleculară), şi a GFP (A11120, 1:500; Probes moleculară). Anticorpi secundari folosite au fost Alexa-fluor conjugat anti-iepure, anti-mouse-ul, anti-cobai şi anti-umane (molecular Sonde).

Imagistica

Live-imagistica a fost realizat intr-o camera de imagistica pentru coverslips mm 18 (QE-1; Warner, Hamden, Connecticut, Statele Unite ale Americii), pe un TE300 Eclipse microscop inversat Nikon folosind un obiectiv 60 × imersie de ulei (1,4 NA). Fluorophores au fost încântaţi de absorbţie la maximele lor, folosind un TILL Photonics (Martinsried, Germania), monocromator combinate cu filtre duble şi triple treci bandă specifică pentru PCP-DsRed şi FITC-Texas Red-Cy5 (Chroma, Battleboro, Vermont, Statele Unite ale Americii). Bleed-prin intermediul de la chromophores în alte canale a fost testat prin intermediul unui singur cromofor şi verificarea tuturor lungime de undă şi alte combinaţii de filtrare pentru semnal detectabil astfel cum a fost descris anterior[9]. Imaginile au fost dobândite succesiv cu un HQ CoolSNAP CCD (Roper ştiinţific, Tucson, Arizona, Statele Unite ale Americii) şi software-ul PCI simplă (C-Imaging, Inc Compix, Cranberry Township, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii). Pentru experimente de contact, imagini vii a fost realizat fie pe un TE Eclipse 300 microscop inversat Nikon cu un obiectiv de 60 × imersie de ulei (1,45 NA) cu excitatie roţi şi filtru de emisie (Instrument Sutter, Novato, California, Statele Unite ale Americii), sau un Zeiss (Thornwood, New York, Statele Unite ale Americii), Pascal sistem confocal cu un obiectiv de 60 × imersie de ulei (1,4 NA). Imagistica a fost realizat cu perfuzie continuă de lichid cefalorahidian artificiale dintr-un sistem de perfuzie gravitate hrănite. Imaginile au fost de obicei colectate de la 25 intervale s, cu condiţia ca acest lucru cel mai bun compromis între rezoluţie temporală mare şi minimizarea toxicitate neuronale şi fotooxidare. Pentru imagini de imunocitochimie, coverslips au fost privite fie cu o Fluoview Olympus 2.1 sistem de scanare cu laser confocal cu un 60 × PlanApo imersie obiectivul de ulei (1,4 NA) la un microscop inversat IX70 sau un Nikon C1 sistem laser confocal de scanare cu un 60 × PlanApo imersie in apa obiectiv (1.2 NA) pe un Nikon TE 2000-U. Imagini pentru fiecare cromofor au fost dobândite succesiv şi peste medie de cel puţin două scanări.

Imunoprecipitare de NLG şi imuno-izolare de NRTPs

Pentru imunoprecipitare, cortexuri a puilor de şobolan P4 au fost omogenizate în 50 mM Tris-HCl pH7.4 într-un omogenizator Dounce-Elvehjem. Membranele au fost granulat prin centrifugare la 100.000 × g timp de 30 de minute la 4 ° C. Extractul a fost concentrat resuspendat în 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH9. Membranele au fost solubilized cu deoxicolat de 1% timp de 45 minute la 37 ° C. Materialul insolubil a fost eliminat prin centrifugare la 100.000 × g timp de 60 de minute la 4 ° C. Triton X-100 a fost adaugat la 0,1%, iar extractele au fost apoi dializată overnight împotriva 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 la 4 ° C. Proteine (1 mg) a fost incubat cu 10-15 μ l de anticorpi NLG sau NR2B peste noapte, proteine G Margele sepharose (Sigma, St Louis, Missouri, Statele Unite ale Americii)) au fost adăugate pentru 1 oră. Margele au fost spălate cu tampon de dializă şi apoi fierte în tampon de probă Laemmli şi transmise la sugative de vest şi de etichetare cu anticorpi (a se vedea detalii mai jos).

Pentru imuno-izolare, de la puii de şobolan cortexuri doi (P2-3) au fost omogenizate în tampon omogenizare (4 mM Hepes (pH 7,4), 0.32 M zaharoză cu inhibitori de protează (Roche, Indianapolis, Indiana, Statele Unite ale Americii))), folosind opt accident vascular cerebral de un omogenizator Dounce-Elvehejm. Omogenatul a fost centrifugat timp de 10 minute la 1000 × g la 4 ° C. Supernatant a fost re-centrifugate timp de 15 minute la 20000 × g la 4 ° C. Dynabeads (1 × 10 8), care au fost preabsorbed cu anticorpi anti-NR1 pe instrucţiunile de companie (Invitrogen, Carlsbad, California, Statele Unite ale Americii) au fost incubate cu 250 μ g de supernatant rezultat creier de şobolan, în prezenţa a 5% din specia bovină overnight albumină serică la 4 ° C. Margele au fost spălate pe larg cu tampon omogenizare şi apoi în tampon de extract concentrat eşantion Laemmli. Pentru solubilizare, unul dintre spălări a fost efectuat cu 0,25% TritonX-100 pentru 30 de minute. Pentru spălare pH-ul ridicat, margele au fost incubate cu soluţie tampon de carbonat de pH11 de 30 de minute. Probele au fost prezentate sugativa de vest şi de etichetare cu anticorpi urmatoarele: anti-NR1 (54,1, 1:500; BD Biosciences Pharmingen), anti-NR2B (Ab1557, 1:500; Biotehnologie Upstate), anti-PSD-95 (K28 / 43, 1:2,000; JS Trimmer), anti-SAP102 (1:1.000; Wenthold R), anti-S-SCAM (1:1.000; Y Hata), anti-VGlut1 (AB5905, 1:1.000; Chemicon), anti-NLG (4F9, 1:1.000; Systems Synaptic), anti-Nlg1 (4C12, 1:1.000; Systems Synaptic), anti-Nlg2 (1:1.000; A El-Husseini), anti-Nlg3 (1:1.000; Un El-Husseini), anti-synapsin1 (AB1543, 1:1.000; Chemicon) şi anti-GluR2 (MAb397, 1:800; Chemicon).

Analiza datelor

Cuantificarea imunocitochimie şi colocalization vii în timpul imagistica a fost efectuată aşa cum este detaliat anterior [7] utilizând imaginile de prime în Image-Pro Plus software-ul, dar cu următoarele modificări (Media Cibernetica, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii).Intensităţile au fost măsurate în termen de aproximativ 1 μ cercuri m diametru în jurul centrului de clustere definit manual în fiecare canal. Pragul folosit pentru a scădea fluorescenţă de fond a fost de intensitate medie fundal dendritice, plus o abatere standard. O abatere standard a fost, în general, pe ordinea de 1,3 ori mai mari decât fundalul dendritice medie. Cuantificarea vitezelor de transport a fost determinată prin măsurarea timpului de la început până la sfârşitul anului o mişcare unidirecţională pentru a da viteza medie. Clusterele au fost considerate telefonie mobilă atunci când au efectuat o mişcare unidirecţională a> 2 μ m în cel puţin trei fotografii succesive.Cuantificarea blots de Vest a fost efectuat cu ajutorul ImageJ (NIH). Intensitatea de probele de control a fost scăzut de la NR1 imuno-izolate probe şi aceasta a fost exprimată ca procent din cantitatea totală. Statisticile au fost analizate în Excel utilizând un doi-coada Student lui t -test.Imaginile au fost prelucrate post-cuantificare utilizând Adobe Photoshop cu titlu de prezentare.

Abrevieri

AMPA: α -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic acid; AMPAR: AMPA receptor; CAM: adeziune moleculă celulă; PCP: cyan proteine fluorescente; CNS: sistemul nervos central; div: zile in vitro ; GFP: proteina verde fluorescentă; MAGUK: membrana asociate cu guanilat kinazei; NLG: neuroligin; NMDA: N-metil-D-aspartic acid; NMDAR: receptorilor NMDA, NR1: NMDAR subunităţi 1; NR2A / B: NMDAR 2A subunităţi / B; NRTP: NMDAR de pachete de transport; NRX: neurexin; PSD: densitatea postsynaptic; SAP: sinapselor asociate cu proteine; S-SCAM: moleculă schele sinaptice; VGlut: glutamat de transport veziculoase.

Interese concurente

Autorii declară că nu au interese concurente.

Autori "contribuţii

AKM şi PW conceput designul acestui studiu şi a scris cea mai mare parte a manuscrisului. PW efectuat multe dintre experimente imagistica vii, mai ales în laborator McAllister cu experimente mai recente imagini în laborator Washbourne. SLB şi CE efectuat unele din imagini live si experimente in laborator imunocitochimice McAllister. JRLC efectuat multe dintre experimente de control în laborator Washbourne. FE-S a efectuat caracterizarea biochimica a NRTPs în laborator McAllister.

Mulţumiri

Această lucrare a fost sustinuta de Pew Charitable Trusts (AKM), National Eye Institute (AKM), John Merck Fondul (AKM), UC Davis Vision Ştiinţă Training Grant EY013584 (CE), Fundaţia Whitehall (PW) şi Autism Speaks (PW). Noi mulţumim lui Peter Scheiffele (Biozentrum, Elveţia), pentru furnizarea de β -NRX-Fc plasmida, Nils Brose (Germania), pentru furnizarea de anticorpi la NLG, James Trimmerul (UC Davis, CA) pentru furnizarea de PSD-95 anticorp, Yutaka Hata (Tokyo medicale şi stomatologice Universitatea), pentru furnizarea de anticorpi S-SCAM, Robert Wenthold (NIH) pentru furnizarea de anticorpi SAP102 şi Alaa El-Husseini pentru furnizarea de PSD-95-GFP si anticorpi pentru a Nlgs 2 şi 3. Mulţumim Lyles Vlasta pentru efectuarea mCherry-N1 şi Leigh A Needleman pentru comentarii utile. Mulţumim, de asemenea, Jo Boule şi Mamiko Niwa pentru asistenţă tehnică de specialitate, Luca Vaughn si Sally Pias pentru ajutor cu cuantificare şi analiză a datelor, şi Jennifer Hoy pentru comentarii la acest manuscris.

Referinte

1. McAllister AK: aspecte dinamice de formare a sinapselor CNS.

   Annu Rev Neurosci 2007, 30 :. 425-450

2. Ziv NE, Garner CC: Principiile de formare a sinapselor glutamatergic: vedeţi pădurea de copaci.

   Pac Neurobiol aviz din 2001, 11 :. 536-543

3. Ahmari SE, Buchanan J, Smith SJ: Adunarea de zone presinaptic activ de la pachetele de transport citoplasmatice.

   Nat Neurosci 2000, 3 :. 445-451>

4. Waites CL, Craig AM, Garner CC: Mecanisme de synaptogenesis vertebrate.

   Annu Rev Neurosci 2005, 28 :. 251-274

5. Scheiffele P: Cell-celula de semnalizare in timpul formarii synapse la nivelul SNC.

   Annu Rev Neurosci 2003, 26 :. 485-508

6. Washbourne P, Dityatev A, Scheiffele P, Biederer T, Weiner JA, Christopherson KS, El-Husseini A: molecule de adeziune celulare în formarea synapse.

   J Neurosci 2004, 24 :. 9244-9249

7. Washbourne P, JE Bennett, McAllister AK: recrutarea rapidă a pachetelor de transport pentru a receptorilor NMDA sinapse curs de formare.

   Nat Neurosci 2002, 5 :. 751-759

8. Rao A, E Kim, Sheng M, Craig AM: eterogenitatea în compoziţia moleculară a site-urilor excitator postsynaptic în timpul dezvoltării de neuroni hippocampal în cultură.

   J Neurosci 1998, 18 :. 1217-1229

9. Washbourne P, Liu XB, EG Jones, McAllister AK: Ciclism a receptorilor NMDA in timpul traficului de neuroni înainte de formarea synapse.

   J Neurosci 2004, 24 :. 8253-8264

10. Niethammer M, Kim E, Sheng M: Interacţiunea dintre terminus C de subunităţi receptorilor NMDA şi mai multor membri ai PSD-95 familie de membrana asociate kinaze guanilat.

    J Neurosci 1996, 16 :. 2157-2163

11. Kornau HC, Schenker LT, Kennedy MB, PH Seeburg: interacţiune între subunităţile Domain receptorilor NMDA şi proteine densitate postsynaptic PSD-95.

    Ştiinţă 1995, 269 :. 1737-1740

12. Bresler T, M Shapira, Boeckers T, Dresbach T, Futter M, Garner CC, Rosenblum K, Gundelfinger ED, Ziv NE: asamblare densitate postsynaptic este fundamental diferită de asamblare presinaptici zona activă.

    J Neurosci 2004, 24 :. 1507-1520

13. Gerrow K, Romorini S, Nabi SM, Colicos MA, Sala C, El-Husseini A: Un complex de proteine preformate postsynaptic este implicat în dezvoltarea sinapse excitatorii.

    Neuron 2006, 49 :. 547-562

14. S Okabe, Kim HD, Miwa A, Kuriu T, H Okado: remodelare continuă de densitate postsynaptic şi regulamentul său de activitate sinaptice.

    Nat Neurosci 1999, 2 :. 804-811

15. Marrs GS, verde SH, Dailey ME: formarea rapidă şi remodelare de densitate postsynaptic în dendrite în curs de dezvoltare.

    Nat Neurosci 2001, 4 :. 1006-1013

16. O Prange, Murphy TH: transportul modulare de densitate postsynaptic-95 clustere şi asociere cu precursori coloanei vertebrale stabilă în timpul dezvoltării timpurii de neuroni corticale.

    J Neurosci 2001, 21 :. 9325-9333

17. Friedman HV, Bresler T, Garner CC, Ziv NE: Adunare de noi sinapse individuale excitator: curs de timp şi ordine temporală de recrutare moleculei sinaptice.

    Neuron 2000, 27 :. 57-69

18. Nguyen T, TC Sudhof: proprietăţi Legarea de neuroligin 1 şi 1beta neurexin dezvăluie funcţionat ca molecule de adeziune de celule heterophilic.

    J Biol Chem 1997, 272 :. 26032-26039

19. Graf ER, Zhang X, Jin SX, Linhoff MW, Craig AM: Neurexins induce diferenţierea de specializări GABA şi glutamatului postsynaptic prin neuroligine.

    Cell 2004, 119 : 1013-1026

20. Nam CI, Chen L: asamblare postsynaptic induse de neurexin-neuroligin interacţiune şi neurotransmitator.

    Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 2005, 102 :. 6137-6142

21. Akins MR, Biederer T: Cell-celulă în interacţiunile synaptogenesis.

    Pac Neurobiol aviz din 2006, 16 :. 83-89

22. Craig AM, Graf ER, Linhoff MW: Cum de a construi o sinapsa central: indicii de la culturi de celule.

    Tendinţe Neurosci 2006, 29 : 8-20.

23. Heine M, Thoumine O, Mondin M, Tessier B, Giannone G, Choquet D: Activity-independente şi specifice de recrutare subunitatea de receptori AMPA funcţională la neurexin / neuroligin date de contact.

    Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 2008, 105 :. 20947-20952

24. Chih B, H Engelman, Scheiffele P: Controlul de formare a sinapselor excitatorii şi inhibitorii de neuroligine.

    Ştiinţă 2005, 307 :. 1324-1328

25. Dean C, Scholl FG, Choih J, S DeMaria, Berger J, Isacoff E, Scheiffele P: mediaza Neurexin de asamblare a terminalelor presinaptice.

    Nat Neurosci 2003, 6 :. 708-716

26. neuroligine medieze excitator şi formarea sinapselor inhibitorii: implicarea PSD-95 şi neurexin-1 beta în neuroligin-induse synaptic specificitate.

    J Biol Chem 2005, 280 :. 17312-17319

27. O Prange, Wong TP, Gerrow K, Wang YT, El-Husseini A: Un echilibru între sinapse excitatorii şi inhibitorii este controlat de PSD-95 şi neuroligin.

    Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 2004, 101 :. 13915-13920

28. Chubykin A, D Atasoy, Etherton MR, Brose N, Kavalali ET, Gibson JR, Sudhof TC:Activitate dependentă de validare de sinapse excitatorii comparativ cu inhibitorii de neuroligin-1 faţă de neuroligin-2.

    Neuron 2007, 54 :. 919-93

29. Varoqueaux F, G Aramuni, Rawson RL, Mohrmann R, Missler M, Gottmann K, Zhang W, Sudhof TC, Brose N: neuroligine determina maturizarea synapse şi funcţia.

    Neuron 2006, 51 :. 741-754

30. Howarth M, Chinnapen DJ, Gerrow K, Dorrestein PC, Grandy MR, Kelleher NL, El-Husseini A, Ting AY: O streptavidin monovalent cu un singur site-ul femtomolar obligatorii biotina.

    Nat Metode 2006, 3 :. 267-273

31. Irie M, Y Hata, Takeuchi M, Ichtchenko K, A Toyoda, Hirao K, Takai Y, Rosahl TW, Sudhof TC: Legarea neuroligine la PSD-95.

    Ştiinţă 1997, 277 :. 1511-1515

32. Fu Z, Washbourne P, P Ortinski, Vicini S: sinapse excitatorii funcţională în celule HEK293 exprima neuroligin şi receptorii glutamat.

    J Neurophysiol 2003, 90 :. 3950-3957

33. Dresbach T, Neeb A, G Meyer, Gundelfinger ED, Brose N: direcţionarea Synaptic de neuroligin este independentă de neurexin şi SAP90/PSD95 obligatoriu.

    Mol Cell Neurosci 2004, 27 : 227-235.

34. Rosales CR, Osborne uscata, Zuccarino GV, Scheiffele P, Silverman MA: Un motiv citoplasmatice obiective neuroligin-1 exclusiv la dendritele de neuroni hippocampal de cultură.

    Eur J Neurosci 2005, 22 :. 2381-2386

35. Comoletti D, Flynn RE, Boucard AA, Demeler B, Schirf V, J Shi, Jennings LL, Newlin HR, Sudhof TC, Taylor P: Gene de selecţie, despicare alternative, şi post-translationale de prelucrare a reglementa selectivitate neuroligin pentru beta-neurexins.

    Biochimie 2006, 45 :. 12816-12827

36. El-Husseini A, E Schnell, Dakoji S, Sweeney N, Zhou Q, Prange O, Gauthier-Campbell C, Aguilera-Moreno A, Nicoll RA, Bredt DS: tăria Synaptic reglementate de plimbări cu bicicleta palmitat pe PSD-95.

    Cell 2002, 108 : 849-863.

37. Huang K, El-Husseini A: Modularea traficului de proteine neuronale şi funcţia de palmitoylation.

    Pac Neurobiol aviz din 2005, 15 :. 527-535

38. Setou M, T Nakagawa, Seog DH, Hirokawa N: kinesin Superfamily de proteine cu motor KIF17 şi mLin-10 în transportul veziculelor receptorilor NMDA care conţin.

    Ştiinţă 2000, 288 :. 1796-1802

39. Okada Y, Yamazaki H, Sekine-Aizawa Y, Hirokawa N: neuron-specific kinesin Superfamily de proteine KIF1A este un motor unic monomerice pentru transport axonala anterograda de precursori veziculelor sinaptice.

    Cell 1995, 81 : 769-780.

40. Hines RM, Wu L, Hines DJ, Steenland H, Mansour S, Dahlhaus R, Singaraja RR, X Cao, Sammler E, Hormuzdi SG, Zhuo M, El-Husseini A: dezechilibru Synaptic, stereotipii, şi interacţiunile sociale depreciate la soareci cu modificat neuroligin 2 exprimare.

    J Neurosci 2008, 28 :. 6055-6067

41. Budreck CE, Scheiffele P: neuroligin-3 este o proteină de adeziune la sinapselor neuronale GABAergic si glutamatergic.

    Eur J Neurosci 2007, 26 :. 1738-1748 <

42. Varoqueaux F, Jamain S, Brose N: neuroligin 2 este exclusiv localizat la sinapselor inhibitorii.

    Eur J Cell Biol 2004, 83 :. 449-456

43. Iida J, S Hirabayashi, Sato Y, Hata Y: molecula de schele Synaptic este implicat în gruparea de neuroligin sinaptice.

    Mol Cell Neurosci 2004, 27 : 497-508.

44. Meyer G, F Varoqueaux, Neeb A, Oschlies M, N Brose: Complexitatea PDZ domeniu interacţiuni mediate la nivelul sinapselor glutamatergic: un studiu de caz privind neuroligin.

    Neuropharmacology 2004, 47 :. 724-733

45. Craig AM, Kang Y: Neurexin-neuroligin de semnalizare in dezvoltarea sinapselor.

    Pac Neurobiol aviz din 2007, 17 :. 43-52

46. Sytnyk V, Leshchyns'ka I, Delling M, G Dityateva, Dityatev A, Schachner M: neuronale moleculei de adeziune de celule promovează acumularea de organite TGN la site-uri de neuron-neuron pentru a-date de contact.

    J Cell Biol 2002, 159 : 649-661.

47. Bresler T, Y Ramati, Zamorano PL, Zhai R, Garner CC, Ziv NE: Dinamica de SAP90/PSD-95 de recrutare pentru noi intersecţii sinaptice.

    Mol Cell Neurosci 2001, 18 : 149-167.

48. Migaud M, P Charlesworth, Dempster M, Webster LC, Watabe AM, Makhinson M, Y El, Ramsay MF, RG Morris, Morrison JH, O'Dell TJ, Grant SG: consolidată potentarea pe termen lung şi de învăţare depreciate la soareci cu mutante densitate postsynaptic-95 proteine.

    Natura 1998, 396 :. 433-439

49. Ziv NE, Smith SJ: Dovezi pentru un rol de filopodia dendritice în synaptogenesis şi formarea coloanei vertebrale.

    Neuron 1996, 17 :. 91-102

50. Lohmann C, Bonhoeffer T: Un rol pentru calciu locale de semnalizare în lista de selectare rapida partenere sinaptice de filopodia dendritice.

    Neuron 2008, 59 :. 253-260

51. S Okabe, Miwa A, Okado H: formarea coloanei vertebrale şi asamblarea corelate de molecule presinaptic şi postsynaptic.

    J Neurosci 2001, 21 :. 6105-6114

52. Hirao K, Hata Y, M Deguchi, Yao I, Ogura M, Rokukawa C, Kawabe H, Mizoguchi A, Takai Y:Asociaţia de sinapselor asociate cu densitate-95-proteine asociate 90/postsynaptic proteine (SAPAP) cu neurofilaments.

    Celule Genele 2000, 5 : 203-210.

53. Hirao K, Hata Y, Ide N, M Takeuchi, Irie M, Yao I, Deguchi M, A Toyoda, Sudhof TC, Takai Y: Un roman multiplu PDZ domeniu care conţin molecule care interacţionează cu N-metil-D-aspartat receptorii neuronali şi adeziune celula proteine.

    J Biol Chem 1998, 273 :. 21105-21110

54. Sans N, K Prybylowski, Petralia RS, K Chang, Wang YX, Racca C, S Vicini, Wenthold JF:NMDA receptor de trafic printr-o interacţiune între proteine PDZ şi complexe exocyst.

    Nat Cell Biol 2003, 5 :. 520-530

55. Sytnyk V, Leshchyns'ka I, Nikonenko AG, Schachner M: NCAM promoveaza de asamblare şi dependentă de activitate remodelare a complexului de semnalizare postsynaptic.

    J Cell Biol 2006, 174 : 1071-1085.

56. Gomes RA, Hampton C, El-Sabeawy F, Sabo SL, McAllister AK: de distribuire dinamic de receptori TrkB înainte, în timpul şi după formarea sinapselor intre neuroni corticala.

    J Neurosci 2006, 26 :. 11487-11500

57. Kim J, Jung SY, Lee YK, S Park, Choi JS, Lee CJ, Kim HS, Choi YB, Scheiffele P, Bailey CH, ER Kandel, Kim JH: neuroligin-1 este necesar pentru exprimarea normală a LTP şi memorie frica asociative in amigdala de animale adulte.

    Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 2008, 105 :. 9087-9092