Pou pirifye ak pwopriyete inik nan mamè selil souch epitelyal

Source: http://www.br.inter.edu/dirlist/Ciencia_Tecnologia/juan_negron/BIOL%202013/ARTICULOS/Stem%20cells.pdf

John Stingi¹'³, Peter Eirew¹, Ian Ricketson¹, Mark Shackleton⁴, François Vaillant⁴, David Choi¹, Haiyan I. Li² & Connie J. Eaves¹'⁵

Èksplikasyon a mekanism yo ki kenbe entegrite mamè epitelyal tisi selilè ak molekilè se nan enterè gran, epi esansyèl nan konsepsyon an ki gen plis tretman pou kansè nan tete 1. Prev nan men tou nan vitro ak nan vivo eksperyans sijere ke diferansyasyon selilè mamè se yon pwosesis yerarchize Originating nan yon selil souch libr ak pwòp tèt ou-renouvèlman potansyèl 2-4. Sepandan, gen analiz de pwopriyete yo ak règleman nan selil souch mamè te limite pa yon mank de metòd pou izòlman fiti yo. Isit la nou rapò itilize nan selil multiparamètr klasman epi limite analiz grèf dekonsantrasyon yo demontre pou pirifye a nan yon sou ki ra nan selil sourit granmoun mamè ke yo kapab endividyèlman relanse yon glann mamè tout nan dènye⁶ semèn nan vivo anmenm tan li ap egzekite jiska dis pwòp tèt ou simetrik renouvèlman divizyon. Sa yo selil souch mamè yo phenotypically distenk sòti ak bay monte selil mamè précurseur epitelyal ki pwodui koloni pratikan nan vitro. selil yo tij mamè yo tou se yon popilasyon rapidman monte bisiklèt nan adilt la nòmal epi gen karakteristik molekilè indicative de yon pozisyon bulb nan epilelyom la mamè.

Glann mamè a devlope aprè l fin fèt soti nan yon ti kantite anvayi selil sòti nan ektodèm nan⁵. Lè sa a, selil sa yo jenere yon seri de branch kanal ki mete fen nan SAC-tankou lobul anbake nan tisi stroma. Estrikti yo ki te pwodwi yo konpoze nan yon epilelyom kontinyèl ki konpozé de yon kouch ekstèn bulb nan selil kontraktil myoepitelyal ak yon kouch entèn nan selil luminal. Eksperyans ak selil sourit retrovirally make mamè transplante'tèt nan otorize kousinen mamè grès yo te etabli egzistans la nan selil souch mamè ki kapab relanse nouvo tisi mamè nan vivo pwòp tèt ou epi montre-renouvèlman aktivite². Isit la nou al gade nan selil sa yo operasyonèlman tankou apatman mamè repopulating (MRUs). Glann mamè tou gen diferan kalite selil précurseur yo ka detekte anba kondisyon nan divès vitro^3,6,7. Mamè koloni-fòme selil (Ma-CFCs), al gade nan moun ki ansètr ki pwodui koloni disrè nan selil mamè nan kilti dansite ki ba-selil pratikan⁷. Koulye a, nan ti kras se li te ye sou pwopriyete yo byolojik nan 'MRUs oswa fòmil yo ki kontwole konpòtman yo ak relasyon nan selil mamè ki proliferasyon nan vitro. Envestigasyon nan kesyon kle sa yo se esansyèl nan devlope yon konpreyansyon sou desizyon mamè selil souch sò ak transfòmasyon.Pou kòmanse nan adrès sa yo 'nou analize fenotip pwopriyete yo ak monte bisiklèt nan selil yo detekte nan vivo kòm MRUs ak konpare yo nan selil detekte nan vitro kòm Ma CFCs.

Nan eksperyans preliminè nou te jwenn ke MRUs ta ka detekte regilyèman nan sispansyon selil yon sèl prepare pa dijesyon anzimatik nan tisi granmoun sourit ak mamè rejenèr macroscopic èkskrwasans mamè aprè 6 semèn ke piki nan otorize kousinen mamè grès nan sevraj sourit fi 8. Èkskrwasans yo ki te pwodwi (figur 1a, b)

yo te istolojikman nòmal (figur 1c) ak ki genyen tou de Keratin matirite 18-eksprime selil luminal e ki lis akten-pozitif nan misk selil myoepitelyal (figur 1d). Nan vitro dozaj la sispansyon selil yon sèl pare soti nan èkskrwasans tankou rejenèr demontre ke yo menm tou yo gen anpil Ma-CFCs (figur 1e), enben, demontre yon relasyon paran-Progeny ant MRUs ak Ma-CFCs.

Envestige si reaggregation nan selil endisosyabl se yon etap esansyèl nan fòmasyon nan MRU-derive èkskrwasans, nimewo ti selil nan vèt pwoteyin fluorescent (gfp)⁹ ak syan fluorescent pwoteyin (CFP)¹⁰ donatè yo te melanje yo ansanm ak transplante'tèt. Pifò èkskrwasans ki pwodui nan sa yo transplantasyon melanje yo te jwenn a ki genyen swa gfp+ oswa CFP⁺ Ma-CFCs, men se pa ni jenotip (figur 1e), bay gwo sipò pou wè a ki selil sèl kapab jenere èkskrwasans konplè. Te Fòmèl prèv ke yo te konsèp sa a yo jwenn nan rezilta yo nan transplantasyon selil sèl lè l sèvi avèk trè fè sèvis pou mete MRUs (figur 1F ak Fig siplemantè¹;. Gade pi ba a pou estrateji seleksyon an fenotipik ak pite MRU reyalize). Nan sa yo eksperyans, selil yo fè sèvis pou mete yo te premye mete nan yon konsantrasyon ki ba nan yon plak multipwi ak sa ki ofwells ki gen sèlman yon selil Lè sa a, chwazi pa enspeksyon mikwoskopik avan ke yo te endividyèlman rekolt ak sou fòm piki nan otorize kousinen grès. Kapasite nan yon selil yon sèl jenere yon dévlòpman (figur 1F) endike ke MRUs kapab montre potansyèl rejenerasyon yo nan absans la nan nenpòt ki selil ko-enjeksyon.

Annakò avèk jwenn sa yo, nou obsève yon negatif relasyon lineyè ant dòz la selil grèf ak pwopòsyon an louvri sesyon ofcleared kousinen grès ki pa t 'gen èkskrwasans lè yo te kantite selil ki sou fòm piki varye (figur 1g). Relasyon sa a tou valide itilize nan limite dekonsantrasyon analiz bay kantite MRUs nan diverses manipile sispansyon nan selil mamè. Frekans la MRUs nan sispansyon selil yo jwenn nan yon sèl granmoun jenn fi fi FVB sourit glann mamè engwino endisosyabl lè l sèvi avèk yon 8-h anzimatik pwosedi te detèmine pa limite analiz dekonsantrasyon yo dwe 1 MRU pou chak 1,400 selil endisosyabl (95 entèval konfyans% = 1 pou chak 600 1 pou chak 3,000 selil, Table siplemantè 1). Sede a total de selil solid jwenn nan pwosedi sa a izolman te apeprè 2 milyon dola pou chak glann. Se poutèt sa, chak glann engwino gen omwen 1,400 MRUs ak pwobableman plis konsidere sede a Enkonplè nan selil yon sèl atann nan pwosedi a izolman itilize yo. Menm jan yo te valè detèmine pou frekans la ak sede nan MRUs nan sispansyon selil yo jwenn nan glann mamè yo nan C57Bl/6 sourit (figur 1e), ki endike rproduktibilite la nan sa yo valè ant tansyon. Notably, lè menm sispansyon ki engwino glann mamè selil yo te analize nan vitro, MA-CFCs yo te detekte nan yon 20-pliye frekans ki pi wo (ki se, 1 Ma-CFC pou chak 63 selil (± sem = 1 pou chak 45 a 1 pou chak 108), endike yon sede nan apeprè 30,000 Ma CFCs-chak glann) an konparezon ak valè yo jwenn pou

1 Terry Fox laboratwa, ak 2 Michael Smith genomic Syans Centre, British Columbia Kansè Agency, Vancouver V5Z 1L3, British Columbia, Kanada. 3 StemCell Technologies Inc, Vancouver V5Z 1B3, British Columbia, Kanada. 4 Walter ak Eliza Hall Enstiti pou Medikal Research, WEHI biyoteknoloji Centre, Parkville, Victoria, 3050, Ostrali. 5 Depatman an Medikal Jenetik, Pathology ak laboratwa Medsin, ak Medsin, University of British Columbia, Vancouver V6T 1Z3, British Columbia, Kanada.

Figi 1 | épreuves a MRU. yon, mamèr dévlòpman glann ki pwodui nan yon pad transplante'tèt grès. Echèl ba, 0.25 cm. b, konpanse grès pad pa enjeksyon ak selil. Echèl ba, 0.25 cm. c, stratifye epilelyom vizualiz nan yon haematoxylin ak glann eozin-tache jwenn nan yon pad grès enjeksyon ak 12 CD452 Ter119 2 CD31 2 mèr-1 ba CD24 med CD49f segondè selil. Arrowheads endike selil myoepitelyal. Echèl ba, 25 am. d, rejenere glann ki montre Keratin selil 18-pozitif luminal (wouj) ak lis akten-pozitif nan misk selil myoepitelyal (vèt). Echèl ba, 10 pm. E, proporsyon nan èkskrwasans pwodwi nan kousinen grès transplante'tèt ak yon melanj de gfp+ ak CFP+ selil (al gade Metòd siplemantè) ki genyen gfp+ ak/oswa CFP+ Ma-CFCs. Asosye Nou Yo nan MRUs nan gfp orijinal la+ ak CFP+ sispansyon yo te 1 pou chak 1,500 (95 entèval konfyans% = 1 pou chak 700 a 1 pou chak 3,000) ak 1 pou chak 2,000 (95 entèval konfyans% = 1 pou chak 910 a 1 pou chak 4,500). Pwobabilite a pou jwenn yon dévlòpman melanje bay sa yo frekans moun te 0.015 (pa anpil diferan de rezilta a obsève nan 2 52 pou chak = 0.04, P = 0.19). f, Yon glann mamè rejenèr nan yon pad grès nan yon lame jenn fi enjeksyon ki gen yon yon sèl CD45 Ter119 2 CD31Sca-1 ba CD24 med CD49f segondè selil (yon bagay ki pozitif pad grès nan 77 enjeksyon ak selil yon sèl). Echèl ba, 1 mm. g, ki negatif relasyon lineyè ant kantite CD45 2 Ter119 2 CD31CD140a 2 CD24 med CD49f segondè selil mamè transplante'tèt ak pwopòsyon an nan kousinen negatif grès jwenn. Te bonte nan anfòm a modèl sa a konfime (P = 0.40).

MRUs. Sa yo jwenn sigjere ke MRUs reprezante yon rar anpil kalite selil pase Ma CFCs-.

Karakterize MRUs plis, nou analize distribisyon yo nan divès kalite subpopulations selil nan anzimatikman dijere glann mamè yo ki te kapab izole lè l sèvi avèk fluoresans triyeuz la aktive selil (FACS) apre tach selil yo ak antikò makè sifas divès kalite.Makè egzamine enkli mèr-1, yon makè te deja dekri yo idantifye MRUs 11; CD24, yon makè pou ki absans la caractérise selil imen timè mamè tij 1; ak CD49f, yon makè a eksprime selil souch epidèrm 12,13 ak moun Ma-CFCs 7. Nan tisi imen mamè, CD24 ki te lokalize manbràn nan Plasma apèks nan selil yo luminal 14, byenke syans ki sanble tisi sourit mamè sijere yon modèl plis omniprésente nan ekspresyon (figur 2a). Nan contrast, CD49f ki pi trè a eksprime selil kouch bulb nan selil po epitelyal15, e li te yon modèl bulb nan ekspresyon konfime isit la pou glann mamè a sourit (figur 2b). Nou jwenn ke lè ki kontamine ematopoyetik (CD45+ ak Ter119+) selil yo te premye retire ak Lè sa a, ki pi trè CD49f+ (CD49f segondè) selil yo te chwazi (figur 2C), swa avèk oswa san similtane seleksyon nan mèr-1 ki ba sou la (selil nan. pòtay lavil la pi ba-dwa ki endike nan Fig 2d), plis pase 50% MRUs ofthe nan sispansyon ofFVB sourit selil mamè ta ka reprann nan yon frekans sèptupl ki pi wo (~ 1 pou chak 200 selil; 4 pozitif kousinen grès soti nan 6 enjeksyon ak 200 selil chak) pase ofMRUs yo frekans nan sispansyon an selil inisyal.

Pa gen MRUs yo te detekte nan mèr-1 segondè sou la nan CD49f+ selil

(0 pozitif kousinen grès soti nan 8 enjeksyon ak 600 selil chak pran depi nan pòtay la anwo-rete nan Fig. 2d). Nou pa t 'kilti selil yo anvan tach paske sa a pwovoke ekspresyon ki nan mèr 1-sou tout selil mamè epitelyal (Fig siplemantè. 2). Lòt yo retire yon elèv ki kontamine andotelyo (CD31+) selil ak seleksyon an CD24 a+ sou la CD45 2 Ter119 2 CD31 2 mèr-1 ba CD49f segondè selil (anwo popilasyon nan Fig. 2e) te ogmante ofthe nan frekans MRUs yon lòt dekupl (to ~ la 1 pou chak 20 selil; 3 pozitif kousinen grès soti nan 4 enjeksyon ak 18 nan selil sa yo yo chak, epi 4 pozitif kousinen grès soti nan 10 ak 12 sou fòm piki nan selil sa yo, ak 0 pozitif kousinen grès soti nan 12 enjeksyon, yo chak ak 312 nan la korespondan CD24 ki ba/sou, Fig. 2e). Gen Démo kat pawol nan CD24 nan MRUs tou yo te demontre deja 16. Lè stroma (CD140a+) selil yo tou te retire men li te mèr-1 tach la omisyon, yo te apeprè 80% nan MRUs yo te jwenn nan yon sou selil ki eksprime nivo mwayèn nan CD24 ak nivo segondè nan CD49f (CD45 2 Ter119 2 CD31 2 CD140a 2 CD24 med CD49f segondè selil). Nan ansanm sa a, frekans nan MRUs te 1 pou chak 60 selil (ki soti nan FVB sourit) ak 1 pou chak 90 selil (ki soti nan C57Bl/6 sourit) (figur 3a ak tab siplemantè 2). An konsekans, sa a te fraksyon te make nan Fig. 3a kòm 'MRU'. Kèk ki rete MRUs yo te jwenn ki gen yon

CD24 ki ba CD49f ki ba fenotipik. Paske imunokolorasyon (figur 2b)

demontre ki diferansye selil myoepitelyal eksprime tou de

CD24 ak CD49f, CD24 ki ba CD49f ki ba fraksyon nan yo montre nan Fig. 3a

te make kòm 'myo' (prevwar sa li ta rich nan kontni li yo nan selil myoepitelyal).

Ma-CFCs, tankou MRUs, yo te jwenn ko-eksprime CD24 tou de ak CD49f (figur 4a). Sepandan, yo diferan de MRUs nan ki pi fò

Ma-CFCs (90%) yo te jwenn nan CD24 segondè CD49f ki ba popilasyon an

ki manke MRUs detekte. Pakonsekan nou ki make CD24 segondè CD49f ki ba fraksyon nan yo montre nan Fig. 3a kòm 'Ma CFC-'. Nou menm tou nou egzamine ki kalite koloni ki te pwodwi pa selil nan Ma-CFC rich la-yo ak MRU-rich fraksyon apre 16 jou nan kwasans nan kilti Matrigel. Koloni yo ki te pwodwi pa selil soti nan fraksyon nan Ma-CFC-rich te gen yon estrikti acinar egzakteman menm jan esferik ki konpoze de yon epilelyom senp cuboidal (panno tèt nan Fig. 3b). Nan contrast, selil soti nan fraksyon nan MRU-rich pwodwi solid, koloni iregilye ki gen fòm ak okazyonèl koloni gwo ak yon aparans branche kanalèr ak yon Cavity iregilye ki gen fòm (figur 3b, pi ba panno).

Kapasite nan Prospective izole distenk, trè rich popilasyon MRUs ak Ma-CFCs opòtinite yo gade pou diferans nan Des ekspresyon jèn yo epi yo yo konpare

Figi 2 | fenotipik karakterizasyon nan MRUs.

yon, CD24+ selil epitelyal, adiposit (arrowheads) ak selil andotelyo (flèch). Echèl ba, 25 am. b, CD49f ekspresyon ki se pi wo nan selil bulb (flèch) pase nan selil luminal (arrowheads). Echèl ba, 25 am. ce, FACS dot simityè ki montre distribisyon an nan selil mamè selon ekspresyon yo nan makè divès kalite. c, CD49f ak pòtay

itilize yo fè distenksyon ant CD49f ki ba ak

CD49f segondè selil. d, CD49f ak mèr-1. E, CD24 (epi voye limyè simen (fsk) karakteristik) nan lespas CD45 Ter119-CD31 2 mèr-1 ba CD49f segondè popilasyon an.

sa yo nan popilasyon an myo ki gen selil trè kèk kapab pwodwi èkskrwasans nan otorize kousinen gen anpil grès oswa koloni pratikan nan vitro. ibridasyon nan amplifié RNA ki soti nan chak nan bagay sa yo ansanbl Affymetrix sourit bato etalaj MOE430 genomic endike ke selil yo Ma-CFC-rich gen ladan pi wo nivo nan, 8 Keratin 18 ak 19 relve nòt ak yon varyete ofcasein relve nòt tou tipik selil ofluminal, an konparezon ak swa MRU rich la-oswa myo selil (Tablo siplemantè 5-7). Kontrèman, relve nòt pou Keewatin 5 ak 14, lis akten nan misk, lis myozen nan misk, vimentin ak laminin, nan tout ki montre ki wo ekspresyon nan selil bulb/myoepitelyal, yo te jwenn yo dwe prezan nan pi wo nivo nan MRU rich la-yo ak myo popilasyon. Sepandan, diferans enpòtan nan ekspresyon jèn yo pa te evidan lè lèt de fraksyon yo te konpare. Diferans ki genyen nan 14, 18 ak 19 Keratin ak nivo lis akten nan misk relve nòt nan twa popilasyon yo etidye

te konfime pa quantitative tan reyèl analiz PCR (figur 3c). Miyò, relve nòt pou 6, Keratin yon précurseur adoptif la makè selil 17, yo tou te jwenn yo dwe pi wo nan fraksyon nan rich nan Ma-CFCs

(Figur 3c).

Imunokolorasyon nan selil endividyèl nan fraksyon ki gen anpil MRU-rich endike ke gen kèk eksprime de makè ki asosye ak selil bulb (23% pozitif pou akten nan misk lis, n = 620; 27% pou Keratin 14, n = 600). Gen lòt ki eksprime makè ki asosye ak selil luminal (18% pozitif pou Keratin 18), men okenn (<0.1%) ko-eksprime makè de tou de liyaj ak mwatye apeprè pa t 'eksprime nenpòt ki ofthese (figur 3D). Imunokolorasyon ofcells izole nan twa fraksyon yo menm ak yon antikò Keratin 6 konfime rezilta yo PCR ak 49% selil pozitif nan fraksyon nan Ma-CFC-rich kòm konpare ak 0-2% selil pozitif nan MRU rich la-yo ak myo fraksyon (Fig. 3e).

Figi 3 | Fonksyonèl ak karakterizasyon molekilè nan ansanbl nan selil mamè. yon, Distribisyon nan CD45 Ter119 CD31CD140a 2 selil dapre CD24 yo ak ekspresyon CD49f. b, Brit mòfolojik (agòch) ak haematoxylin ak eozin-tache seksyon (adwat) ofcolonies pwodwi nan

Matrigel kilti soti nan CD24 segondè CD49f ki ba selil (Ma-CFC fraksyon, sou tèt panel) ak nan CD24 med CD49f segondè selil (MRU fraksyon, mwayen ak

anba panno). Echèl ba, 2 mm (panno agòch) ak 20 (panno dwat la).

c, Quantitative tan reyèl PCR analiz de nivo relve nòt nan subpopulations diferan (vle di ± sem nan done ki sòti nan twa Izola endepandan kòm konpare ak selil unfractionated glann mamè). K, Keratin lan.

d, imunokolorasyon nan FACS-fè sèvis pou mete CD45Ter119CD31 CD49f segondè selil (MRU fraksyon) pou yo eksprime sa yo Keratin 14 (vèt) ak Keratin 18 (wouj.) Echèl ba, 10 pm. E, Keewatin 6+ CD24 segondè CD49f ki ba selil (Ma-CFC fraksyon). Flèch yo endike autofluorescence; echèl ba, 10 pm.

Figi 4 | karakterizasyon nan lank fwit ak pwopriyete monte bisiklèt nan MRUs ak Ma-CFCs. yon, Pousantaj (± sem) nan Ma CFCs-an subpopulations endike yo. b, Distribisyon nan CD45 2 Ter119 2 CD49f+ selil mamè dapre fluoresans HOECHST yo 33342 (kite pòtay lavil, popilasyon bò; dwa pòtay, ki pa Peye-bò kote popilasyon). c, Distribisyon nan selil mamè dapre CD49f ekspresyon yo epi yo Rho aktivite fwit. d, Distribisyon

Pòtab sik etap

nan selil CD45 mamè nan G0, G1 ak S/G2/M detèmine pa HOECHST

33342/pyronin Y tach. Sa yo fraksyon ki genyen 38 ± 11%, 59 ± 11%

ak 3 ± 1% (vle di ± sem), respektivman, nan tout CD45 selil yo.

E, Pousantaj (± sem) nan MRUs ak Ma-CFCs nan G0 G1 a, ak S/G2/M

fraksyon.

Vin genyen plis karakterize MRUs ak Ma-CFCs, nou egzamine Hoechst33342 yo epi yo rodamin-123 (Rho) fwit pwopriyete, osi byen ke distribisyon yo nan faz diferan nan sik la selil. HOECHST 33342 se yon substra nan Abcg2 ak sa-a pèmèt Abcg2+ selil yo montre yon inik fenotipik 'bò kote popilasyon' 18,19. HOECHST 33342 ak Rho fwit pwopriyete, yo toulède yo karakteristik fè diskriminasyon nan selil tranquil murin tij ematopoyetik 20 men sa yo pwopriyete ki pèdi, lè selil sa yo aktive nan sik 21.Primitiv rtenol 22 ak selil kadyak 23, selil souch anbriyon 19 ak kèk selil mamè 24 gen tou yo te rapòte yo posede yon fenotipik popilasyon bò. Nou te jwenn ke preparasyon glann mamè tou gen yon fraksyon ti selil popilasyon segondè (1.9 ± 0.5% (vle di ± sem) nan total la, n = 7, Fig. 4b), men sa yo matirite pou mwens pase 10% nan tout MRUs yo (Table siplemantè 3). Menm jan an tou, yon minorite nan CD491+ selil mamè effluxed Rho (figur # 4c), ak sa a te vrè tou pou tou de MRUs (Table siplemantè 4) ak Ma-CFCs (figur 4a). Analiz de HOECHST 33342/pyronin Y-tache selil mamè (figur 4d) te montre ke tout MRUs yo ak.95% nan Ma CFCs a-te prezan nan fraksyon yo G1 oswa S/G2/M (figur 4e). MRUs yo tou te lajman distribiye nan karakteristik pi devan simen yo limyè, jan yo espere a pou yon popilasyon monte bisiklèt (done yo pa montre). Rezilta sa yo se ki konsistan avèk yon rapò ki resan nan yon popilasyon monte bisiklèt nan selil mamè epitelyal te panse yo dwe primitif paske nan kapasite yo nan kenbe 3 H-timidin 5 semèn apre yon ekspoze batman kè nan vivo 25.

Self-renouvèlman an se pwopriyete a Hallmark nan selil souch. Egzaminen pwopriyete yo oto-renouvèlman an MRUs sèl, 34 kousinen grès yo te transplante'tèt avèk chif ki ba (11-42) nan MRU rich-(CD24 med CD49f segondè) selil. Paske èkskrwasans yo te pwodwi nan sèlman 11 nan 34 kousinen yo gen anpil grès enjeksyon, ki pi ofthese ta ka sipoze gen parèt soti nan yon sèl MRU. Segondè dekonsantrasyon limite dozaj MRU te fèt sou sispansyon selil pare soti nan 4 nan sa yo 11 èkskrwasans prensipal, epi rezilta yo demontre yo ke yo genyen 25, 110, 190 ak 1,200 MRUs, respektivman. Kidonk, trè fè sèvis pou mete yon sèl

MRUs ta ka montre yo egzekite omwen dis simetrik oto-renouvèlman divizyon.

Sa yo jwenn endike yon yerachi nan différencier selil ki nan glann mamè adilt la ki genyen ladan l tij devlopman distenk ak Prospective familye ak kalite selil précurseur idantifye pa quantitative nan vivo ak nan vitro dozaj. Kapasite nan izole selil sa yo kòm popilasyon distenk kouche sèn nan pou delimiter nan lavni nan ki jan mamè se selil souch endepandan kap RENOUVLE, epi diferansyasyon nòmalman reglemante ak pèrturbasyon pandan kanserojenèz. Segondè aktivite proliferatif ofsteady-eta MRUs a sijere yon wòl enpòtan mekanism ofapoptotic nan règleman an nòmal nan selil sa yo ak pouvwa amelyore vilnerabilite yo nan evènman mutagens.

Metòd

Preparasyon pou Pòtab. glann mamè soti nan 8-14-semèn-fin vye granmoun jenn fi fi FVB, C57Bl/6, oswa congenic gfp 9 ak CFP 10 sourit yo te dijere pou 8h a 37 ° sen EpiCult-B ak 5% fetis la serik estipid (FBS), 300 U ml 1 collabo genase ak 100 U ml 1 yaluronidaz. Prolongation nan peryòd la nan dijesyon anzimatik a 16 h a nan yon diminye selektif ak Eightfold jeneral nan sede MRU. Apre vortèks ak liz nan selil wouj ki nan san an NH 4 Cl, se te yon sispansyon selil yon sèl jwenn nan izolman nan sekans fragman yo pa piptaj dou pou 1 2min-an 0.25% trypsin, ak Lè sa a, 2min nan 5 mgml 1 II dispase plis 0.1mgml21 DNase mwen (DNase; Sigma) ki te swiv pa filtraj atravè yon may 40-pm. Tout réactifs yo te nan men StemCell Technologies Inc sof si espesifye.

Separasyon Pòtab. CD45+/Ter119+, CD31+ ak CD140a+ selil te retire lè l sèvi avèk EasySep pou twous lan seleksyon biyotin (StemCell Technologies) apre tretman nan selil endisosyabl ak 2 p gml 1 antikò reseptè Fè (2.4G2 yo, Ameriken Koleksyon Kilti Kalite) ki te swiv pa 10min ak yon 1:500 dekonsantrasyon an StemSep byotinile murin/moun ki tap fèt chimères (StemCell Technologies), 1 p gml 1 byotinile anti-CD31 (script MEC13.3, Pharmingen) ak 1 p gml 1 biotiny-formule anti-CD140a (script APA5, eBioscience). Nan kèk eksperyans, selil yo te enkubatèd pou 10 min nan 10% serik rat ak 10 p gml1 2.4G2 ak Lè sa a, anti-CD45-allophycocyanin (APC, script 30F11, Pharmingen), anti-CD24-R-phycoerythrin (PE, script M1/69, Pharmingen), byotinile anti-CD31, anti-CD49f-PE oswa izotyosyanat fluoreseinik (FITC, script GoH3, Pharmingen), oswa

APC (R & D Sistèm) ak byotinile mèr-1 oswa mèr-1-PE (script E13-161.7, Pharmingen). Selil apoptotik yo te ekskli byelimination ofannexin-V+ selil apre tach ak annexin-V-APC (Pharmingen). Pou dozaj la MRUs nan Ranje popilasyon, nimewo selilè solid yo te detèmine pa konte mikwoskòp anvan enjekte selil yo nan otorize kousinen grès. Pou transplantasyon yon sèl CD45 2 Ter119 2 CD31 2 mèr-1 ba CD24 med CD49f segondè selil, sa yo ki te premye distribiye nan 1 selil chak 3 pwi nan Terasaki plak (Greiner Biyo-One) ak vizyèlman tcheke anvan seleksyon pou piki. Selil yo te tache ak Rho, oswa HOECHST 33342 ak/oswa pyronin Y ak pòtay mete menm jan li te dekri 21,26 ak modifikasyon an ki EpiCult-B ak 5% FBS te itilize pandan 37 ° C etap la enkubasyon. Tout kalite te fèt lè l sèvi avèk yon FACSVantage oswa FACSAria (BECTON DICKINSON) ak pòtay yo te mete eskli.99.9% ofcells make ak izoform-matche antikò kontwòl Couplet ak fluorokrom yo korespondan.

Nan vitro dozaj koloni. Pifò Ma-CFCs dozaj te fèt nan estanda 5-6-jou kilti likid jan yo te dekri pou moun Ma CFCs- 27. Èkskrwasans épreuves pou MA CFCs-, halfofthe sispansyon jwenn ki soti nan chak dévlòpman te plake nan yon plat sèl ak koloni yo ki te pwodwi 5 jou apre konte lè l sèvi avèk yon mikwoskòp regilye yo ak genotyped lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan. Tout koloni yo te sèlman gfp+ oswa CFP+. Nan chwazi eksperyans, koloni yo te jenere nan 50 -p kilti l nan Matrigel (BECTON DICKINSON) kouvri ak 4 ml Epicult-B medyòm ki gen 5% FCS. Apre 16 jou, chak 50 -p te l Matrigel kilti fiks nan 4% paraformaldeid ak Lè sa a, retire entak, anbake nan 1% agaroz, fiks ankò nan 4% paraformaldeid, sèksyone ak tache ak haematoxylin ak eozin.

Nan vivo dozaj nan otorize kousinen mamè grès. glann mamè a 21-jou-fin vye granmoun sourit fi FVB oswa C57Bl/6J yo te otorize nan epilelyom andojèn jan yo te dekri 28, ak tès selil ki nan 5-10 nan solisyon balanse sèl Hanks 'plis 2% FBS ak 10% ble trypan (Sigma) te sou fòm piki nan chak otorize pad grès.Twa semenn apre operasyon an, sourit yo te kwaze eksepte nan transplantasyon selil yo sèl ak kèk transplantasyon ofthe donatè melanje selil. Apre yon semèn of6 total, glann yo te èksize ak tache ak Alum Carmine (StemCell Technologies) oswa haematoxylin pou tout mòn-analiz. Nan sourit ki te kwaze, sèlman èkskrwasans ranpli ki gen eleman tou de lobulèr ak kanalèr yo te bay nòt tankou yon pozitif, byenke trè kèk èkskrwasans ki gen sèlman youn nan eleman sa yo te wè nan san transplantasyon plizyè fèt. Te frekans nan MRUs nan sispansyon an selil ke yo te kalkile lè l sèvi avèk transplante'tèt Poisson Statistik ak metòd la nan chans maksimòm lè l sèvi avèk lojisyèl L-Calc (StemCell Technologies) 29. Lè tout kousinen grès yo te swa pozitif oswa negatif, te yon estimasyon de ranje nan frekans MRU jwenn lè l sèvi avèk yon sèl-sided 95% Clopper Pearson limit. Te bonte nan anfòm nan yon sèl-frape nan modèl Poisson fè tès ak Statistik estanda Chi-okib.

Gade Metòd siplemantè pou plis detay sou imunositochimi, mikwo-etalaj ak kantitatif tan reyèl PCR analyses.

Resevwa 12 Oktòb; aksepte 22 Novanm 2005. Published sou entènèt 4 janvye 2006.

1. AlHajj, M. & Clarke, MF Self-renewaland selil solid tij timè. onkojèn 23, 7274-7282 (2004).

2. Kordon, 'EC' & Smith, GH Yon tout glann functionalmammary pouvwa genyen Progeny a soti nan yon selil sèl. Devlopman 125, 1921-1930 (1998).

3. Dontu, G. et al. Nan vitro pwopagasyon ak transcriptionalprofiling nan selil imen mamè tij/précurseur. Jèn Dev. 17, 1253-1270 (2003).

4. Stingl, J., raouf, A., Emerman, JT & Eaves, CJ Epithelialprogenitors nan glann mamè a normalhuman. J. Mamm. Byol glann. Neoplazi 10, 49-59

(2005).

5. Sakakura, T. nan gland nan mamèr: Devlopman, Règleman, ak fonksyon (eds Neville, MC & Danyèl, CW) 37-66 (Plenum, New York, 1987).

6. Smalley, MJ, Titley, J. & O'Hare, MJ Clonalcharacterization nan myoepithelialcells luminalepithelialand sourit mamè ki separe pa fluoresans-aktive cellsorting. Nan Pòtab vitro. Dev. Byol. Anim. 34, 711-721 (1998).

7. Stingl, J., Eaves, CJ, Zandieh, I. & Emerman, JT karakterizasyon nan selil bipotent mamè précurseur epitelyal nan nòmal tisi tete granmoun imen. Res kansè nan tete. Trete 67, 93-109 (2001).

8 Smith, GH eksperimantal mamè morfojenèz epitelyal nan yon nan vivo modèl: prèv pou ansètr distenk selilè nan fenotipik la lobulèr ductaland. Tete Res Kansè. Trete. 39, 21-31 (1996).

9. Miz, AJ, Sherwood, RI, Christensen, JL & Weissman, IL Little prèv pou plastisit devlopman nan selil granmoun tij ematopoyetik.

Syans 297, 2256 - 2259 (2002).

10. Hadjantonakis, AK, Macmaster, S. & Nagy, A. selil souch anbriyon yo ak sourit yo eksprime variants gfp diferan pou l 'miltip ki pa-pwogrese repòtè nan yon bèt sèl. BMC Biotechnol. 2, 11 (2002).

11. Wlem, OU DWE et al. mèr-1 POS selil ki nan glann mamè a sourit reprezante yon précurseur rich popilasyon selil. Dev.. Byol 245, 42 - 56 (2002).

12. Tani, H., Morris, RJ & Kaur, P. Anrichisman pou selil murin tij keratinosit ki baze sou fenotipik cellsurface. Proc. NATL Acad. Sci. USA 97, 10960-10965 (2000).

13. Li, A., Simmons, PJ & Kaur, P. Idantifikasyon ak izolasyon nan kandida selil imen tij keratinosit ki baze sou fenotipik sifas selil. Proc. NATL Acad. Sci. USA 95, 3902-3907 (1998).

14. Jones, C. et al. profilage Démo kat pawol nan fè sèvis pou mete normalhuman selil myoepithelialbreast luminaland:. idantifikasyon nan makè novelprognostic pou kansè nan tete Kansè Res. 64, 3037-3045 (2004).

15. Carter, w, Kaur, P., Gil, SG, Gahr, PJ & Wayner, fonksyon EA disten pou entegrin alfa 3 beta 1 nan focaladhesions ak alfa 6 beta 4/bullous antijèn pemphigoid nan yon nouvo kontakte ki estab mare (SAC) nan keratinosit:. relasyon ak hemidesmosomes J. Pòtab byol. 111, 3141-3154 (1990).

16. Shackleton, M. et al. jenerasyon nan yon glann mamè fonksyonèl ki sòti nan yon selil souch sèl. Lanati 439, 84-88 (2006).

17. Li, Y. et al. Prèv ki montre transjèn kodaj konpozan nan trajektwa a siyal Wnt preferans pwovoke kansè mamè nan selil précurseur. Proc. NATL Acad. Sci. USA 100, 15853-15858 (2003).

18. GOODELL, MA, Brose, K., Paradis, G., Conner, AS & Mulligan, Izolasyon RC ak pwopriyete fonksyonèl nan selil murin tij ematopoyetik ke yo kreye nan vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).

19. Zhou, S. et al. Bcrp1/ABCG2 se la transporter ABC ki eksprime nan yon gran varyete selil souch epi li se yon detèminan molekilè nan fenotipik la bò kote-popilasyon an. Lanati Med. 7, 1028-1034 (2001).

20. Spangrude, GJ & Johnson, GR Repoze ak aktive ansanbl nan selil multipotent ematopoyetik tij sourit. Proc. NATL Acad. Sci. USA 87, 7433 - 7437

(1990).

21. Uchida, N. et al. aktivite transporter ABC nan selil murin tij ematopoyetik varye selon developmentaland estati deklanchman yo. san 103,

4487 - 4495 (2004).

22. Bhattacharya, S. et al. Dirèk idantifikasyon ak anrichisman nan selil retinalstem/ansètr pa épreuves HOECHST fwit lank. Envesti. Ophthalmol. Vis. Sci. 44,

2764 - 2773 (2003).

23. Hierlihy, PM, Seale, P., moso, CG, Rudnicki, MA a & Megeney, LA

Post-Natal kè gen yon tij popilasyon veso selil. FEBS lèt. 530,

239 - 243 (2002).

24. Alvi, AJ et al. Functionaland molekilè karakterizasyon nan selil mamè popilasyon bò. Res kansè nan tete. 5, R1-R8 (2003).

25. Smith, GH Mete etikèt sou-repwan selil epitelyal nan glann mamè sourit divize asimetrik epi konsève aspè modèl ADN yo. Devlopman 132,

681 - 687 (2005).

26. Glimm, H., Oh, I. & Eaves, C. Imèn selil souch ematopoyetik ankouraje proliferasyon nan vitro pèdi potansyèl engraftment pandan S/G yo 2/ M transpò piblik ak

pa fè sa rerantre G0. san 96, 4185 - 4193 (2000).

27. Stingl, J., Emerman, JT & Eaves, CJ nan Metòd nan Biyoloji Molecular: Pwotokòl Debaz Kilti Pòtab (eds Helgason, CD & Miller, CL) 249-263 (umana,

New Jersey, 2005).

28. Young, LJT nan Metòd nan Biyoloji gland mamèr ak Rechèch kansè nan tete (eds IP, MWA & Asch, BB) 67-74 (Kluwer/Plenum, New York, 2000).

29. Szilvassy, ​​SJ, Nicolini, fe, Eaves, CJ & Miller, CL nan Metòd nan Medsin Molecular: Pwotokòl ematopoyetik selil souch (eds jordon, CT & Klug, CA)

167 - 187 (umana, New Jersey, 2002).

Enfòmasyon sou siplemantè se lye nan vèsyon an sou entènèt nan papye a nan www.nature.com/lanati. Se yon figi rezime tou te gen ladann.

Remèsiman sa a te travay sipòte pa don Rezo a selil souch Kanadyen yo ak genomic BC/Kanada. JS ki te fèt bours postdoktoral soti nan Kanadyen Fondasyon an kansè nan tete (BC/Yukon Chapter) ak Syans natirèl li yo, Jeni Rechèch Konsèy la Kanada; PE te kenbe yon Pòtab bous Rezo Stem; IR ak DC ki te fèt British Columbia Kansè Studentships pandan ete Fondasyon; epi MS te kenbe yon Bousdetid soti nan Sante ak Medikal Nasyonal la Rechèch Konsèy nan Ostrali. Otè yo mèsi Ontario Genomics Centre nan Inovasyon pou fè pus yo, Terry Fox laboratwa FACS Lonjitid la pou asistans nan klasman selilè, G. Edin ak KM Saw pou asistans teknik, ak Eaves A., S. Aparicio, C. Fisher ak D. Kent pou diskisyon syantifik.

Kontribisyon Author JS, PE, IR ak DC fè pi fò nan eksperyans yo ki dekri nan maniskri la. MS ak fv fè kèk nan transplantasyon selil yo sèl. HIL analize done an mikropus ak JS, PE ak CJE ki fèt syans yo ak wrote maniskri la.

Enfòmasyon sou Author ka done yo mikropus dwe rantre sou entènèt la nan StemBase (http://www.scgp.ca:8080/StemBase/) ak nan Omnibus la Démo kat pawol Gene (seri nimewo asansyon GSE3711) nan http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Geo/sijè rechèch/acc.cgi? acc = GSE3711. Repwodwi ak enfòmasyon autorisations ki disponib nan npg.nature.com/reprintsandpermissions. Otè yo deklare pa gen okenn konpetisyon enterè finansye. Yo ta dwe korespondans ak demann pou materyèl nou kapab kontakte CJE (ceaves@bccrc.ca).