Cromatografie

Source: http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/Bio750/Chromatography.html

Partition I. Între Două faze

A. Pâlnie de separare

1. două lichide nemiscibile- substanţelor dizolvate solubil în ambele
2. Coeficientul de partiţie,K = C,_U/ C_L după echilibrului
3. K depinde de:
   1. solvat- polaritate, ionizare, etc
   2. 2 faze lichid- polaritate, etc
4. Dacă K>> K 1 sau <<1 la un anumit soluţiei==> poate purifica soluţiei destul de bine cu o singură extracţie(sau extracţii relativ puţine). Dar ce se întâmplă dacă K este aproximativ egal cu 1?

B. multiple Extracţii

1. Să ne uităm la două cazuri:(a) K= 1(b) K= 3
2. în cazul în careK> 1==> mai multe materiale în cele mai multe nave dreapta-> mută de vârf la dreapta rapid
   dacăK <1 ==> mai multe materiale în vase de stânga-> mută de vârf la dreapta mai lent
   (în diagramele de mai jos, faza inferioară stă în loc, în timp ce faza superioară este transferată nava de lângă dreapta cu faza inferioară proaspăt.)
   

   a.	K= 1					b.	K= 3
   1/ 2						3/ 4
   1/ 2						1/ 4
   1/ 4	1/ 4					3/ 16	9/ 16
   1/ 4	1/ 4					1/ 16	3/ 16
   1/ 8	1/ 4	1/ 8				3/ 64	18/64	27/64
   1/ 8	1/ 4	1/ 8				1/ 64	6/ 64	9/ 64
   1/ 16	3/ 16	3/ 16	1/ 16			3/ 256	27/256	81/256	81/256
   1/ 16	3/ 16	3/ 16	1/ 16			1/ 256	9/ 256	27/256	27/256
   1/ 32	1/ 8	3/ 16	1/ 8	1/ 32		3/ 1024	36/1024	162/1024	324/1024	243/1024
   1/ 32	1/ 8	3/ 16	1/ 8	1/ 32		1/ 1024	12/1024	54/1024	108/1024	81/1024

   
   
   

3. Cum poate fi realizat acest lucru de multe ori în mod automat?
   ==>Craig Counter aparate de distribuţie curent- pâlnie de separare de construcţii

Cele două faze sunt echilibrate în camera B, prin balansarea tubului înainte şi înapoi, în jurul valorii de pivot punct,P. După echilibrare, aparatul este rotit 90, astfel încât faza superioară merge înD, în timp ce faza inferioară rămâne înB. Atunci când aparatul este rotit înapoi(invers acelor de ceasornic) 90, faza superioară curge în vas următoare prin tubE. Fază mai sus pot fi adăugate la această navă prin tubA

Puterea de acest aparat constă în faptul că se poate asambla 100 de aceste nave(baloane) impreuna pentru a face 100 de extrageri(transferuri). Acestea au fost apparati foarte elaborata si costisitoare.

Există acum mai bine mult mai puţin costisitoare metode, dar ele sunt bazate pe acelaşi principiu de partiţii a unei solut între două faze.

Al II-lea. Coloana cromatografică

Partition A. de solut(e) între două faze

1. Faza staţionară - ambalare materia coloana
2. Faza mobil- fluid care trece prin

B. Placa Teoria

1. Coloana este împărţit(conceptual) în zonele consecutive numite plăci
   1. Fiecare placă este o lungime de coloană suficientă pentru a intrării în vigoare o distribuţie echilibru între cele două faze==> Înălţime Echivalent cu o placă teoretică(HETP)
   2. Dimensiunea BHE dintr-o placă este determinată de: material de umplutura coloanei(suprafaţă, etc), rata de curgere, etc
2. O farfurie= un singur transfer într-o pâlnie de separare==> mai lungă coloană, plăcile atat contine mai multe şi mai bine rezoluţia.

C. Cromatografie celuloză- Cartea Cromatografia

1. Celuloza are numeroase grupuri hidroxil, care sunt obligati polari şi a H₂ O. Obligat H₂ O estefaza staţionară.
2. Flow-un alt trecut cu solvent de celuloză/ H₂ O==> devinefaza mobilă. Fază mobilă cu solvent vor fi mai puţin polare decât H₂ O; este de obicei un amestec de solventi organici(alcooli, cetone, aldehide, etc) şi, eventual, apă.
3. Soluţi partiţie între H₂ O în faza staţionară şi solvent a fazei mobile. Se poate schimba caracteristicile de separare prin schimbarea polarităţii fazei mobile(de exemplu, reglaţi compoziţia).
4. Cartea Cromatografie- cea mai comuna forma de celuloză cromatografie
   1. soluţiei este "reperat" pe "uscat" de hârtie(conţine încă H₂ O)
   2. cromatograf este "dezvoltat prin scufundarea un capăt în faza mobilă două moduri:.Crescator siDescrescator
   3. Se mişcă cu solvent prin hârtie, trase prin capilaritate
   4. Soluţi muta ca pete, cu o rată în funcţie de cât de mult timp petrec in faza de staionary Raport cu faza mobilă- determinate de coeficientul de partiţie acestora- măsurat ca o valoare Rf.
   5. poate fi combinat cu electroforeză hârtie==> 2-dimensional tehnica adesea utilizate pentru a separa peptide produs prin digestia tripsina==>Peptide de amprente

Gel de permeabilitate D. Cromatografie- o sită moleculară de cromatografie

1. Coloana de ambalare - margele sferice poros de dimensiuni definite
   1. reticulat dextrani- Sephadex(Pharmacia)
   2. poliacrilamidă reticulat- Bio-Gel P(Bio-Rad)
   3. reticulat agaroză- Sepharose(Pharmacia) sau Biogel A(Bio-Rad). Margele agaroză au porii foarte mari şi sunt, prin urmare, bun pentru a separa molecule foarte mari
   4. alte materiale dezvoltate de alte companii
2. Margele Gel sunt concepute pentru a avea o distributie de dimensiuni porilor în jurul valorii de o dimensiune a porilor medie. Dimensiunea porilor medie şi de distribuţie determină dimensiunea de molecule care pot fi separate.
3. Volumul total(volumul de pat gel): V_T= V_O+ V_g+ V_i
   [V_o este volumul de spaţiu dintre margele, volumul gol; V_g este volumul de material gel în margele; V_i este volumul porilor în cadrul margele, volumul inclus]
   1. Soluţiei va partiţie între V_O şi V_I: m_i= s V_i c în cazul în care s este coeficientul de partiţie şi c este concentraţia solutului în V_o.
   2. Fiecare tip de moleculă are un coeficient de partiţie caracteristic, e, cu privire la fracţiunea de volumul inclus V_i, accesibil la faptul că molecula(câte porii sunt suficient de mari pentru molecula de a intra).
   3. limitele s:
      • s= 0==> moleculele soluţiei nu poate intra în margele gel de la toate(exclus), deoarece porii sunt prea mici
      • s <1==> molecule soluţiei sunt mai puţin susceptibile de a fi în margele decât în volumul de gol, V_o, deoarece unele porii sunt prea mici
      • s= 1==> soluţiei partiţie de molecule în mod egal între volumul gol, V_o, şi volumul inclus, V_i.
      • s > 1==> molecule soluţiei adsoarbe la material gel(nedorite, de obicei, dar apare uneori)
   4. Volumul de accesibile şirag de mărgele de molecule soluţiei este: V_p= e V_i==> s= V_p/ V_i
4. Eluţia Coloana Gel- probă este aplicat ca o bandă subţire şi clătite prin(eluat) cu soluţie tampon.
   1. Fiecare tip de moleculă eşantion trebuie să treacă prin întregul volum de care dispun deplasând un volum de tampon egal cu volumul la dispoziţia molecule.
   2. Volumul de eluare: V_e= V_O+ E V_I Astfel, pentru....
      • s= 0==> V_e = V_O <- foarte molecule mari
      • s <1==> V_e= V_O + E V_i <- intermediar molecule mijlocii
      • s= 1==> V_e= V_O+ V_i <- molecule mici
5. Volumul de eluare este o măsură de dimensiuni moleculare
   1. normalizarea eluare prin exprimarea V_e ca s= V_p/ V_i
   2. s=-A "log R_h+ B '==> r_h= raza sferei hidratat(rază Stokes)
   3. pentru o serie de molecule omoloage(forma similara, V, etc) r_h este proporţională cu M^{1/ 3}, astfel, s-A= B+ M log <- ecuatia are aceeaşi formă cu o pantă şi intercepta nou==>Gel cromatografia de permeabilitate poate fi folosit pentru a "estima" MW
      

Alte tipuri de cromatografie partiţiilor

E./ gaz cromatografia de lichide

1. Faza mobil este un gaz- de obicei inert(El, Ar, N₂)
2. Faza staţionară este un lichid de acoperire pe un suport solid inert.
   1. tub deschis sau exploatarea capilar- strat de suprafata interioara a unui tub subtire de lungă(30- 100 m lungime)
   2. coloană umplută- coloana cu diametru mai mare este dotat cu un suport inert- pământ de obicei diatomit, praf de teflon, sau bile de sticlă.
   3. acoperire pot fi solide la temperatura camerei(de exemplu, polietilen glicol) bu coloana va rula la temperatură mai mare de acoperire în cazul în care se topeşte.
3. De propoziţii, de obicei, injectat ca un lichid, care este apoi încălzit la o probă vaporiza==> trebuie să fie oarecum volatile şi stabile la temperaturi mai ridicate.
4. Poate asigura o rezolutie foarte mare de a face columnes foarte lung
5. Detectoare: diverse tipuri. Cel mai puternic detector este un spectrometru de masă(GC/ Mass Spec.) Care oferă spectru de masă care pot fi utilizate pentru a identifica şi quantitate probe ca ei provin de pe coloana.

F. fază inversă cromatografie

1. Faza staţionară - apolar(hidrofob)==> inversat cu privire la celuloză cromatografie
   1. lanţuri de hidrocarburi- legat la o matrice inert; hidrofob variat prin schimbarea lungimii lanţului de hidrocarburi
   2. aromatice grupuri
2. Faza mobil- depinde de hidrofob fazei staţionare. Utilizaţi de obicei, o mai solvent organic polar: acetonitril, DMSO, EtOH, etilen glicol, propanol, sau amestecuri ale acestora cu H₂ O. De asemenea, pot utiliza degradeuri.
3. Utilizarea de lanţuri de hidrocarburi mai scurte mai puţin dens se numeşte
   cromatografie Interacţiuni hidrofobic

G. Ion Cromatografie de schimb

1. Faza staţionară - grupuri legate chimic perceput
   1. Trebuie să aibă ioni contra legat
   2. într-adevăr este clasificat ca cromatografia de absorbţie, deoarece faza staţionară conţine un anumit număr de site-uri la care se pot lega substanţelor dizolvate reversibil.
2. Faza mobilă- o soluţie tampon apoasă caracterizat prin: pH-ul şi tăria ionică
3. Proprietăţi ale schimbătorilor de ioni:
   1. Natura sprijin solid:
      • polistiren/ divinil benzen- Dowex- mecanic foarte puternic
      • Din alte materiale plastice- acrilice, fenolice, epoxidice
      • celuloză
      • dextrani- Sephadex
      • agaroză- Sepharose <- ultimele două sunt utilizate în mod obişnuit pentru cromatografie permeaţie gel, dar poate fi modificat pentru a conţine grupuri de perceput pentru schimbul de ioni cromatografie.
   2. Natura grupuri Charged:
   3. Schimbători de cationi- au sarcină negativă
   4. Schimbatoare de anion- au sarcina pozitiva
4. Schimbatoare de puternic Ion: bazate pe acizi sau baze puternice şi plătesc într-o gamă largă de pH-ului
   1. schimbătoare de cationi puternic: sulfonic(sau derivate) R-SO₃^-
   2. schimbătoare de anioni puternic: săruri de amoniu cuaternar RN(CH₃)⁺
5. Schimbatoare de slabe Ion: bazate pe acizi slabi sau baze, care plătesc doar pentru un interval limitat pH-ului
   
   1. schimbătoare de anioni slab: dietil-amino-etil(DEAE); amine terţiare
   2. schimbătoare de cationi slab: carboxi metil(CM); fosforil
   3. Acestea pot fi lipite la o varietate de suporturi: de exemplu, DEAE-celuloză; DEAE-Sephadex; DEAE-Sepharose; CM-celuloza; CM-Sephadex; CM-Sepharose
6. Alegerea unui schimbător de ioni
   1. Charge- cationi sau schimbătorul de anioni- depinde de taxa de molecule care urmează să fie separate. Acest lucru va depinde de asemenea de pH-ul.
   2. Schimbator de slab- pentru molecule instabil, cum ar fi proteinele.
   3. Schimbator de puternic- pentru molecule mai stabile, cum ar fi nucleotide, aminoacizi, peptide, etc
      
7. Elutie Ion Coloane de schimb- molecule, de obicei, adsoarbe bine în zona-tampon în care sunt aplicate==> trebuie să slăbească această interacţiune.
   1. Creşterea tăria ionică(metoda cea mai frecvent): F= q₁ q₂/ D r²
      q₁ şi q₂ sunt tarifele pe 2 grupuri, r este distanţa dintre grupuri, iar D este constanta dielectrică de solvent care este a crescut cu tăria ionică mai mare slăbind astfel forţa între soluţiei şi a schimbătorului de ioni. Un alt mod de a privi acest lucru este faptul că alţi ioni în tampon concura pentru site-ul schimbatorul de ioni cu caracter obligatoriu.
   2. pH-ul schimba- schimbări privind taxele moleculelor fiind separate; de asemenea, poate modifica tariful unui schimbător de ioni slab
   3. Aceste modificări pot fi făcute treptat prin schimbarea rezervor tampon(degrade pas) sau ca degrade- prin amestecarea a două tampoane

III. Variaţii în Aparatură- cele mai multe dintre aceste moduri pot fi executate în următoarele moduri.

A. Cromatografie în strat subţire

1. Faza solid/ staţionare este un strat subţire pe un suport plat
2. Dezvoltat ca un cromatograma de hârtie(dip în faza lichidă mobil)

B. HPLC- de înaltă presiune(de performanţă) cromatografia de lichide

1. Creşterea Rezoluţia de cromatografie de lichide de către...
   1. utilizarea particule foarte mici pentru a obţine suprafaţa extinsa posibile- 3- 20 diametru μ
   2. de înaltă presiune(până la 400 atmosfere), necesare pentru a obţine tarife acceptabile debit- necesită particule foarte puternice pentru a rezista la comprimare pat şi zdrobirea de particule
   3. zeci de mii de "plăci" pe metru din lungimea coloanei oferă o rezoluţie excelentă
2. Utilizate în cele mai multe dintre modurile comune discutate mai sus, deşifază inversă este probabil cel mai comun tip de HPLC
3. Avantaje: rezoluţie foarte mare(inlocuieste cromatografie de hârtie/ electroforeză în cele mai multe aplicaţii) şi ori pe termen scurt.